王少平,姜 珊,趙一慕,林 鶯,張加余,代 龍

(1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264003;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250000)

土鱉蟲(chóng)，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉(EupolyphagasinensisWalker)及中華冀土鱉(SteleophagaPlancyiBoleny)的干燥雌蟲(chóng)體，具有活血逐瘀、續(xù)筋接骨的功效[1]?，F(xiàn)代臨床主要用于高血脂、骨折、高尿酸血癥等疾病的治療[2]。土鱉蟲(chóng)富含蛋白質(zhì)，經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道土鱉蟲(chóng)蛋白質(zhì)占到總蟲(chóng)體質(zhì)量的60%[3]。然而，大分子蛋白無(wú)法被人體整體吸收，需經(jīng)胃腸道蛋白消化酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿踊钚噪暮蠓侥鼙晦D(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入人體發(fā)揮藥效作用。而土鱉蟲(chóng)主要以復(fù)方形式經(jīng)口服給藥方式發(fā)揮藥效作用。因此，本實(shí)驗(yàn)前期基于蛋白質(zhì)消化原理和土鱉蟲(chóng)給藥特點(diǎn)提出以胃蛋白酶、胰蛋白酶為酶介質(zhì)的體外仿生酶解技術(shù)。并采用此技術(shù)對(duì)土鱉蟲(chóng)蛋白質(zhì)進(jìn)行處理得到了土鱉蟲(chóng)生物活性肽(active peptide ofEupolyphaga，APE)。

高脂血癥為人體常見(jiàn)代謝性疾病之一，臨床表現(xiàn)為血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)異常升高；高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)降低[4-6]。大量臨床文獻(xiàn)研究腸道菌群的多樣性可保證脂質(zhì)的正常吸收與代謝。高脂血癥患者腸道菌群存在不同程度的缺陷。而調(diào)整腸道菌群則可降低高脂血癥患者血清內(nèi)的血脂指數(shù)。這也說(shuō)明腸道菌群與高脂血癥之間存在緊密聯(lián)系[7-10]。

土鱉蟲(chóng)作為“活血化瘀”藥物已在臨床應(yīng)用千年，但是APE是否可以調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善高脂血癥狀，目前未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)建立飲食性高脂血癥SD大鼠模型，利用 16S rDNA方法檢測(cè)SD大鼠的腸道菌群變化，探討APE對(duì)腸道菌群多樣性以及高脂血癥的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器 土鱉蟲(chóng)經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院林鶯副教授鑒定為鱉蠊科中華冀土鱉的雌蟲(chóng)，購(gòu)自山東省長(zhǎng)清土元養(yǎng)殖場(chǎng)；大鼠代謝籠；TC、TG、LDL和HDL生化試劑盒(購(gòu)自南京建成生物鑒定所提供)；ML104型十萬(wàn)分一、ME104E型萬(wàn)分之一天平(梅特勒上海精密儀器公司)、萊卡TD203石蠟包埋機(jī)；美國(guó)伯樂(lè)T90組織切片機(jī)；250 mL生理鹽水(山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán))、600 mL去離子水(浙江娃哈哈純凈水公司)、10 L飲用純凈水(濟(jì)南普利斯飲用水公司)、戊巴比妥鈉(國(guó)藥試劑有限公司)甲醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析級(jí)；產(chǎn)自天津富宇化學(xué)試劑廠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，♂；體質(zhì)量：(180～200) g，由山東省朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1APE制備 取土鱉蟲(chóng)藥材500 g，粉粹過(guò)80目篩，加入去離子水5 000 mL，加熱煮沸，保持15 min；后放涼至40 ℃，調(diào)pH至1.5；加入5.0 g胃蛋白酶，37 ℃酶解1 h。再調(diào)pH至8.5，加胰蛋白酶酶解3 h；酶解完成加熱煮沸15 min，冷卻后保存12 h。離心，取上清液，得土鱉蟲(chóng)粗酶解液。采用電滲析儀器對(duì)土鱉蟲(chóng)粗酶解液進(jìn)行脫鹽實(shí)驗(yàn)，得土鱉蟲(chóng)脫鹽液。將土鱉蟲(chóng)脫鹽液用3 000 ku超濾膜處理，得到APE溶液。

1.2.2肽含量測(cè)定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用文獻(xiàn)報(bào)道的folin方法[11]進(jìn)行肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.2.2.2APE含量 取APE溶液50 mL，冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得干燥品，加入適量去離子水溶解。采用“2.2.1”肽標(biāo)準(zhǔn)曲線方法對(duì)APE溶液進(jìn)行肽含量測(cè)定。重復(fù)6次，計(jì)算平均值。

1.2.3高脂血癥大鼠模型建立

1.2.3.1造模方法 SD大鼠，60只；適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后分組，分別為空白組、模型組、辛伐他汀組、土鱉蟲(chóng)活性高、中、低劑量組，每組10只。給藥劑量為；APE劑量組為1.5、0.75、0.375 g·kg-1。除空白組外，其他各組大鼠采用特定的高脂飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，高脂飼料組成為基礎(chǔ)飼料65%、豬油15%、膽固醇5%、蛋黃10%、膽汁酸鈉5%。持續(xù)造模45 d，于d 46開(kāi)始，土鱉蟲(chóng)各組大鼠給予規(guī)定劑量藥物，給藥15 d后取各組大鼠新鮮糞便，肝臟，血清等樣品，所有生物樣品保存至-80 ℃冰箱。

1.2.3.2檢測(cè)指標(biāo) 采用石蠟包埋機(jī)和冷凍切片機(jī)對(duì)各組大鼠肝臟進(jìn)行處理制得肝臟切片，并結(jié)合蘇木精-伊紅(HE)染色方法制得各組大鼠肝臟病理切片，在200倍電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。同時(shí)采用TG、TC、LDL和HDL生化試劑盒對(duì)各組大鼠血清進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)肝臟病理變化和血脂四項(xiàng)變化判斷造模情況。

1.2.3.3大鼠菌群測(cè)定 取空白組、模型組、APE高劑量組大鼠新鮮糞便，提取腸道微生物 DNA，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并添加樣本特異性Barcode序列，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶對(duì)rRNA基因可變區(qū)(單個(gè)或連續(xù)的多個(gè))或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，接著采用lllumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫(kù)，最后使用MiSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.2.3.4數(shù)據(jù)處理方法 應(yīng)用SMCAP15.1軟件(USA；2016)采用組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行基于有效數(shù)據(jù)的OTUs聚類(lèi)分析，再對(duì)所獲得的OTU進(jìn)行Alpha多樣性和Beta 多樣性計(jì)算，結(jié)合t檢驗(yàn)，以P<0.05為閾值得出代表序列的物種注釋、物種信息和基于物種的豐度分布情況。

2 結(jié)果

Fig 1 Result of peptide standard curve

2.2 高脂血癥大鼠血脂恢復(fù)情況

2.2.1肝臟HE染色結(jié)果分析 各組大鼠肝臟HE染色病理切片顯示：空白組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核染色清晰可見(jiàn)，同時(shí)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、變性、壞死等病理變化。而模型組肝組織結(jié)構(gòu)不完整，界限不清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞核模糊不清，肝竇消失，肝細(xì)胞脂滴分布密集，部分脂滴形成大空泡，這一結(jié)果說(shuō)明造模后肝細(xì)胞出現(xiàn)泡沫化。與模型組比較，陽(yáng)性藥組肝細(xì)胞恢復(fù)良好，肝結(jié)構(gòu)完整，界限清晰，APE高、中、低劑量組肝脂肪變性程度均有不同程度的改善，脂滴體積比較小，大部分肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列相對(duì)整齊。說(shuō)明APE可以改善脂肪過(guò)量攝取引起的肝臟細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果見(jiàn)Fig 2。

2.2.2血脂四項(xiàng)測(cè)定結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清中的TG、TC、LDL和HDL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)Tab 1。由表可知，長(zhǎng)期給予高脂飼料，模型組大鼠血液內(nèi)TG、TC和LDL的含量較空白組明顯上升，HDL含量則明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明模型制作成功。陽(yáng)性藥組、辛伐他汀可以明顯降低高脂血癥大鼠血液內(nèi)TG、TC、LDL含量，同時(shí)升高HDL含量。APE給藥后，大鼠TG、TC、LDL含量明顯下降，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)。說(shuō)明APE可以下調(diào)高脂血癥大鼠血液內(nèi)TG、TC、LDL的含量。

2.3 菌群測(cè)定結(jié)果

2.3.1門(mén)相對(duì)豐度分析 與空白組進(jìn)行比較，模型組大鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度明顯下降，而擬桿菌門(mén)、軟壁菌門(mén)的相對(duì)豐度則明顯增加。而經(jīng)APE干預(yù)后，給藥組大鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度增加，而擬桿菌門(mén)、軟壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著下降，見(jiàn)Fig 3。

Tab 1 Results of blood lipid in rats

#P<0.05,##P<0.01vsBlank group;*P<0.05,**P<0.01vsModel group

Fig 2 Pathological results of HE stainingA:Blank group;B：Model group;C：Simvastatin group;D：High dose group;E：Middle dose group;F：Low dose group.

Fig 3 Relative abundance experimental results of PhylumA：The relative abundance mean results of Phylum; B：The relative abundance results of Phylum with all samples; C: The heatmap results of Phylum.

2.3.2綱相對(duì)豐度分析 與空白組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)擬桿菌綱相對(duì)豐度則明顯上升，而梭狀芽胞桿菌相對(duì)豐度明顯下降。經(jīng)APE干預(yù)后，給藥組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、梭狀芽胞桿菌豐度明顯升高，而擬桿菌綱則明顯下降，見(jiàn)Fig 4。

2.3.3目相對(duì)豐度分析 與空白組大鼠進(jìn)行比較，模型組大鼠腸道內(nèi)擬桿菌目、梭菌目相對(duì)豐度明顯上升，而乳桿菌目相對(duì)豐度明顯下降。經(jīng)APE干預(yù)后，給藥組大鼠腸道內(nèi)乳桿菌目、桿菌目豐度明顯升高。而梭菌目、擬桿菌目豐度明顯下降，見(jiàn)Fig 5。

2.3.4菌群差異物種分析 與空白組比較，模型組大鼠腸道菌群組成發(fā)生明顯變化，芽孢桿菌、乳酸桿菌、狄氏副擬桿菌、雙歧桿菌明顯下降，而馬賽博斯氏菌含量乳酸菌噬菌體含量、旋毛形線蟲(chóng)數(shù)量則明顯上升，經(jīng)APE干預(yù)后，給藥組大鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌含量明顯增加，而擬桿菌屬的產(chǎn)酸菌、馬賽博斯氏菌含量則明顯下降，見(jiàn)Fig 6。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于SD大鼠高脂血癥動(dòng)物研究土鱉蟲(chóng)生物活性肽降血脂和對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，土鱉蟲(chóng)生物活性肽可明顯降低高脂血癥大鼠血清內(nèi)TC、TG、LDL 的水平，升高HDL水平，這一現(xiàn)象則說(shuō)明土鱉蟲(chóng)具有明顯的降血脂功效。 進(jìn)一步通過(guò) 16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)分析各組大鼠腸道菌群分布情況，此方法可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)的微生物體外培養(yǎng)導(dǎo)致的菌落種群丟失以及結(jié)構(gòu)變化等不足。研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腸道菌群多樣性和豐度不同程度降低，與 Martinez 等[12]報(bào)道一致。給予APE后，大鼠腸道菌群豐度及多樣性均有一定程度改善。Ley等[13]報(bào)道正常動(dòng)物的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較肥胖個(gè)體顯著降低，結(jié)果顯示，APE可降低高脂血癥大鼠擬桿菌門(mén)、軟壁菌門(mén)豐度。說(shuō)明APE可以通過(guò)降低擬桿菌門(mén)、軟壁菌門(mén)豐度實(shí)現(xiàn)對(duì)血脂的間接干預(yù)。

高脂血癥發(fā)生時(shí)，腸道中微生物賴(lài)以生存的環(huán)境將會(huì)發(fā)生改變，其理化性質(zhì)及物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變則會(huì)直接破壞雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌等有益菌的生長(zhǎng)繁殖，使其數(shù)量急劇減少，而使得擬桿菌和梭菌等革蘭氏陰性菌含量增加。有害菌的增加使得腸道產(chǎn)生過(guò)氧化炎癥因子和脂質(zhì)抑制因子，例如脂多糖(LPS)和氧化三甲胺(TMAO)[14-15]，這些因子會(huì)直接抑制脂質(zhì)的氧化代謝，增加脂質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的堆積。本實(shí)驗(yàn)表明，APE可以調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠腸道菌群變化，也可以降低模型大鼠血液內(nèi)血脂含量，推測(cè)APE可能通過(guò)改善腸道菌群種類(lèi)并抑制相關(guān)因子達(dá)到干預(yù)脂質(zhì)代謝的作用。后期實(shí)驗(yàn)對(duì)此機(jī)制進(jìn)行深入研究。

Fig 4 Relative abundance experimental results of ClassA:The relative abundance Mean results of Class;B:The relative abundance results of Class with all samples;C:The heatmap results of Class.

Fig 5 Relative abundance experimental results of OrderA:The relative abundance Mean results of Order;B:The relative abundance results of Order with all samples;C:The heatmap results of Order.

Fig 6 Relative abundance experimental results of SpeciesA:The relative abundance Mean results of Species;B:The relative abundance results of Species with all samples;C:The heatmap results of Species.