劉 敏 王 閣

(新疆兵團(tuán)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊 830000)

肝癌作為世界第五大最為常見(jiàn)的癌癥，每年的新發(fā)肝癌病例和死亡病例均超過(guò)7 000萬(wàn)例[1]。血液檢查和影像學(xué)檢測(cè)是目前普查肝癌的主要手段，由于患者早期癥狀不典型且病程發(fā)展快，臨床上大約有80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。機(jī)體內(nèi)基因異常表達(dá)一般先于腫瘤的發(fā)生，因此從基因水平上尋求一種更為靈敏的肝癌早期診斷生物學(xué)標(biāo)記物成為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，微小RNA(microRNA，miR)在腫瘤性疾病中一般被作為抑癌基因或原癌基因加以研究，是近幾年的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(suppres-sor of cytokine signaling,SOCS)是一種細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子，可通過(guò)負(fù)反饋抑制多條信號(hào)通路，是JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要抑制因子，可通過(guò)抑制JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗腫瘤作用?，F(xiàn)有研究已證實(shí)，肝癌病灶組織中SOCS家族的SOCS1和SOCS3均呈低表達(dá)，SOCS1和SOCS3的啟動(dòng)子異常甲基化是沉默其表達(dá)和誘發(fā)腫瘤的一個(gè)重要原因，可預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度及患者預(yù)后[2-4]。有研究證實(shí)SOCS1和SOCS3均是miR-203a-3p的靶基因[5,6]，本研究分析循環(huán)miR-203a-3p表達(dá)與組織SOCS1、SOCS3的關(guān)系，為肝癌的臨床診治提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 選取我院2017年5月至2018年5月收治的50例原發(fā)性肝癌患者作為研究組，其中男31例，女19例，年齡37～71歲，平均(51.23±4.36)歲。另招募50例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男26例，女24例，年齡35～73歲，平均年齡(53.14±5.23)歲。兩組患者的年齡和性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：首次診出為原發(fā)性肝癌，無(wú)既往治療史；近6個(gè)月內(nèi)無(wú)免疫調(diào)節(jié)史；自愿簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2試劑與儀器 namodropND-1000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自大連TaKaRa公司；GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自德國(guó)Promega公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；miR-203a-3p引物、小鼠抗SOCS3單克隆抗體、核酸提取試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgM購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；兔抗SOCS1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit購(gòu)自美國(guó)ZYMO RESEARCH公司。

1.2方法

1.2.1樣本提取方法 50例肝癌患者于確診后，治療前抽取晨8:00時(shí)外周肘靜脈血，即刻送檢；于手術(shù)過(guò)程中留取肝癌組織和癌旁2 cm以上的健康組織，-70℃保存。50例健康志愿者于體檢時(shí)抽取晨8:00時(shí)外周肘靜脈血，即刻送檢。

1.2.2循環(huán)miR-203a-3p表達(dá)測(cè)定方法 Trizol裂解法提取研究組和對(duì)照組全血樣本總RNA，用nanodropND-1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-203a-3p表達(dá)，主要步驟：①所得總RNA樣本，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。②使用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒和ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)miR-203a-3p表達(dá)。miR-203a-3p引物上游序列：5′-CCGGTGAAATGTTTAGGACCACTAG-3′；下游序列：5′-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3′；內(nèi)參為U6。③每個(gè)樣本的目的基因做3個(gè)重復(fù)，取平均Ct值根據(jù)公式：n=2-ΔΔCt計(jì)算miR-203a-3p表達(dá)量。

1.2.3組織SOCS1和SOCS3的蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)病灶組織和癌旁組織SOCS1和SOCS3的蛋白表達(dá)，主要步驟：① 使用裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解凍存的肝組織，充分裂解后將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，保存于-20℃?zhèn)溆?。?使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。③進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。④ 80 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h；室溫條件下5%的脫脂奶粉封閉60 min；分別加入兔抗SOCS1單克隆抗體和小鼠抗SOCS3單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜；分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgM，室溫孵育90 min。⑤曝光、顯影、定影。顯影后掃描膠片，用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以各組條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，代表各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4組織SOCS1和SOCS3甲基化程度測(cè)定方法 采用核酸提取試劑盒提取病灶組織和癌旁組織的基因組DNA。采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒，對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。目的基因SOCS1、SOCS3和內(nèi)參基因β-actin使用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及空白對(duì)照分別為Human Methylated DNA、Human Non-methylated DNA以及雙蒸水。PCR產(chǎn)物的電泳采用1.5%的瓊脂糖凝膠，電泳后在溴化乙錠溶液中染15 min，最后在凝膠成像儀中觀察并分析電泳圖。

2 結(jié)果

2.1循環(huán)miR-203a-3p的表達(dá)水平 研究組循環(huán)miR-203a-3p的表達(dá)水平為0.829±0.208，對(duì)照組為1.596±0.304，研究組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2組織SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)水平 研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)水平分別為0.825±0.322和0.624±0.200，癌旁組織分別為0.285±0.096和0.352±0.185，病灶組織均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖2。

圖2 組織SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison in protein expression level of SOCS1 and SOCS3Note: A.Protein expression of SOCS1.The left figure is the Western blot sample.The right figure is the histogram of 50 patients；B.Protein expression of SOCS3.The left figure is the Western blot sample.The right figure is the histogram of 50 patients.

2.3組織SOCS1和SOCS3基因甲基化水平 研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3甲基化表達(dá)水平分別為0.805±0.062和0.652±0.062，癌旁組織分別為0.105±0.026和0.154±0.026，病灶組織甲基化表達(dá)水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；研究組病灶組織的SOCS1和SOCS3非甲基化表達(dá)水平分別為0.012±0.002和0.013±0.003，癌旁組織分別為0.352±0.046和0.285±0.085，病灶組織非甲基化表達(dá)水平均低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見(jiàn)圖3。

2.4循環(huán)miR-203a-3p與SOCS1和SOCS3表達(dá)水平的相關(guān)性分析 肝癌患者血清循環(huán)miR-203a-3p表達(dá)水平與肝癌組織SOCS1和SOCS3蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.576、0.475，P<0.05)；與SOCS1和SOCS3基因甲基化程度呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.585、-0.579，P<0.05)；其相關(guān)直線如圖4所示。

圖3 組織SOCS1和SOCS3基因甲基化水平比較Fig.3 Comparison in methylation level of tissue SOCS1 and SOCS3Note: A.Methylation expression of SOCS1,the above diagram is the MSP experimental sample (M represents methylation expression,U represents non-methylation expression).The below diagram is the histogram of 50 patients；B.Methylation expression of SOCS3,the above diagram is the MSP experimental sample (M represents methylation expression,U represents non-methylation express-ion).The below diagram is the histogram of 50 patients.

圖4 血清循環(huán)miR-203a-3p表達(dá)水平與各個(gè)指標(biāo)的相關(guān)直線Fig.4 Correlation line between expression level of serum circulating miR-203a-3p and various indicatorsNote: A.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS1 protein expression in liver cancer patients;B.Circulating miR-203a-3p expression and the SOCS3 protein expression in cancer tissues；C.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS1 methylation expression in cancer tissues；D.Circulating miR-203a-3p expression and SOCS3 methylation expression in cancer tissues.

3 討論

肝癌是全球發(fā)病率最高的癌癥之一，由于其發(fā)病前期癥狀不明顯，病情發(fā)展較快，因此給肝癌患者的早期診斷和及時(shí)有效治療帶來(lái)了一定的難度。為了實(shí)現(xiàn)肝癌患者的早期診斷和更好的治療，明確肝癌的發(fā)病機(jī)制非常關(guān)鍵，本研究探討了肝癌組織中循環(huán)miR-203a-3p表達(dá)水平與SOCS1和SOCS3表達(dá)水平及其甲基化水平的關(guān)系，以期為完善肝癌發(fā)病機(jī)制和為尋求一種早期診斷肝癌的靈敏指標(biāo)奠定一定的基礎(chǔ)。

miR-203在多種腫瘤中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，抑制miR-203表達(dá)可促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖，重新表達(dá)可抑制Hela細(xì)胞增殖[7-9]。Furuta等[10]研究證實(shí)miR-203在肝癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，而用甲基化酶抑制劑5-氮雜-2脫氧胞苷處理后可恢復(fù)miR-203的表達(dá)水平，說(shuō)明其下調(diào)可能是由甲基化所致；上調(diào)肝癌細(xì)胞miR-203表達(dá)水平可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，推測(cè)miR-203是一種新型的肝癌表觀遺傳學(xué)沉默腫瘤抑制miRNAs[11，12]。miR-203a-3p與miR-203高度同源，在肝癌患者中可能也具有抑癌作用。SOCS1和SOCS3屬SOCS家族的成員，是由細(xì)胞產(chǎn)生并能夠反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可抑制Janus 酪氨酸激酶-信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(Janus tyrosine kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)信號(hào)通路異常激活引發(fā)的細(xì)胞增殖。王紅雷等[13]應(yīng)用對(duì)比分析了肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中的SOCS3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SOCS3在癌組織中表達(dá)水平下調(diào)，且其具體水平與腫瘤大小、分化程度以及患者的生存期有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，SOCS3啟動(dòng)子區(qū)甲基化是導(dǎo)致SOCS3表達(dá)沉默和腫瘤活動(dòng)增強(qiáng)的一個(gè)重要原因，在針對(duì)乙肝病毒(HBV)相關(guān)性肝癌和原發(fā)性肝癌的臨床研究中均發(fā)現(xiàn)了類似情況[14，15]。符常波等[16]發(fā)現(xiàn)SOCS1低表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，SOCS1失活會(huì)導(dǎo)致JAK-STAT信號(hào)通路過(guò)度持續(xù)激活，腫瘤細(xì)胞侵襲性增加和病情惡化，Gui等[17]也得出了相仿的結(jié)論，認(rèn)為SOCS1的甲基化程度與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)SOCS1在乙肝病毒(HBV)相關(guān)性肝癌的病灶組織和正常組織均有陽(yáng)性表達(dá)，且病灶組織中的甲基化狀態(tài)增強(qiáng)，并指出SOCS1的甲基化削弱了SOCS1對(duì)抑癌基因p53的正向調(diào)節(jié)作用，是HBV相關(guān)性肝癌發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。

事實(shí)上，多種類型腫瘤中常存在SOCS基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，使得SOCS1和SOCS3表達(dá)降低，JAK2-STAT信號(hào)通路異化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖[19]。Aniagu等[20]認(rèn)為在肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中 SOCS1甲基化呈動(dòng)態(tài)變化：初期階段甲基化主要發(fā)生在 SOCS1基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白水平；隨著癌癥進(jìn)一步發(fā)生，甲基化則逐漸蔓延至基因啟動(dòng)子的CpG島。Lena等[21]通過(guò)將腺病毒轉(zhuǎn)染miR-203進(jìn)入小鼠角阮細(xì)胞中之后，SOCS3的表達(dá)水平有小幅度上升，認(rèn)為SOCS3有可能是miR-203的靶基因，但并不一定是直接靶基因。因此，有關(guān)miR-203與SOCS1、SOCS3的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者的miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3表達(dá)水平均有所下調(diào)，SOCS1和SOCS3的甲基化水平則呈上升趨勢(shì)，同時(shí)miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3的表達(dá)水平在肝癌患者中呈正相關(guān)關(guān)系，與SOCS1和SOCS3的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明兩者可能共同參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，miR-203a-3p可能對(duì)原發(fā)性肝癌的SOCS1、SOCS3甲基化修飾有影響，有望為其臨床診治提供新靶點(diǎn)。miRs調(diào)控靶基因的機(jī)制復(fù)雜，miR-203a-3p和SOCS1、SOCS3的具體關(guān)系及其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。