伊宏煜 張津睿 胡海峰 張 野 陳麗華 連建奇

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染病科，西安 710032)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)感染長(zhǎng)期以來(lái)一直是全球公共衛(wèi)生安全的重要威脅，盡管隨著乙肝疫苗的應(yīng)用，乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染人數(shù)逐年下降，但全世界目前仍有大約2.5億人正在經(jīng)受著HBV感染所帶來(lái)的危害[1,2]。乙肝感染的慢性化與機(jī)體免疫狀態(tài)有著非常密切的關(guān)系，既往研究證實(shí)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的“耗竭”在HBV慢性化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而以巨噬細(xì)胞為主的固有免疫應(yīng)答在乙肝感染慢性化中的作用也成為了研究的熱點(diǎn)[3,4]。巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)中重要的一類細(xì)胞，它有很強(qiáng)的異質(zhì)性，在不同刺激條件下，巨噬細(xì)胞可向經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞或替代活化的M2型巨噬細(xì)胞方向分化[5]。然而，在HBV感染背景下巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)及其免疫應(yīng)答效應(yīng)尚缺乏詳盡研究。有報(bào)道稱，HBV感染可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2方向分化，并抑制機(jī)體免疫反應(yīng)[6]，但另有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子從而發(fā)揮病毒清除的作用[7,8]。巨噬細(xì)胞亞群和自身免疫狀態(tài)的差異很可能是決定乙肝感染清除或慢性化的重要因素。

研究表明，乙肝相關(guān)抗原如表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)可抑制巨噬細(xì)胞表面模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)從而削弱巨噬細(xì)胞功能，但乙肝核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)對(duì)巨噬細(xì)胞的作用并不明確。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)能夠識(shí)別HBcAg并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子[9]，而另有研究發(fā)現(xiàn)，HBcAg在肝臟枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)介導(dǎo)的HBV免疫耐受中發(fā)揮著重要作用[10]。

本研究分析比較了HBV與HBcAg對(duì)PMA誘導(dǎo)的THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)的CD86、CCR7和M2極化相關(guān)的CD206、CD163的表達(dá)水平以及THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子水平變化，試圖闡明HBcAg對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，從而為進(jìn)一步探索乙肝感染慢性化的免疫學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 人白血病單核細(xì)胞系THP-1、人肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG2.2.15來(lái)自空軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室凍存；佛波酯(PMA)購(gòu)自Abcam；流式抗體CD86-FITC、CCR7-PE、CD163-FITC、CD206-PE、TLR2-BB515購(gòu)自BD Biosciences；重組HBcAg購(gòu)自ProSpec；TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA試劑盒購(gòu)自上海西塘生物；Trizol、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)自TaKaRa；RT-qPCR所需引物合成自上海生工生物工程。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞處理 參照文獻(xiàn)[11]的方法，將THP-1細(xì)胞以5×105ml-1鋪在6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基，同時(shí)加入PMA 25 ng/ml刺激THP-1 48 h將其誘導(dǎo)成M0巨噬細(xì)胞。預(yù)先將貼壁的HepG2、HepG2.2.15以5×105ml-1轉(zhuǎn)移至6孔板大小的Transwell小室上室中，待THP-1分化為巨噬細(xì)胞后，將上室移入6孔板，此時(shí)上室為HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞，而下室為THP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞，分別共培養(yǎng)24 h，收集下室THP-1細(xì)胞提RNA以及流式細(xì)胞染色，并收集下室培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。另取一塊6孔板，將THP-1細(xì)胞以5×105ml-1鋪在6孔板，每孔2 ml培養(yǎng)基，用同樣方法誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，然后換新鮮培養(yǎng)基，分別加入10 μg/ml重組HBcAg和等體積PBS作對(duì)照，培養(yǎng)24 h后收集THP-1提RNA以及進(jìn)行流式細(xì)胞染色，并收集培養(yǎng)上清做ELISA檢測(cè)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè) 用細(xì)胞刮刀將THP-1細(xì)胞收集于離心管，并于管中加入流式抗體(CD86、CD163、CD206、CCR7)孵育，每組用同型對(duì)照抗體(iso)做對(duì)照，染色結(jié)束后，用PBS洗滌2遍，流式固定液固定后用BD流式機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)，并用FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.2.4RT-qPCR檢測(cè)THP-1的CD86、CCR7、CD 163、CD206、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β等基因的表達(dá)情況 收集處理后的THP-1細(xì)胞，用Trizol裂解并提取RNA，測(cè)定其在260 nm處的吸光度以確定RNA濃度，隨后用SYBR法在Bio-Rad上進(jìn)行qPCR反應(yīng)，每組基因均以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.5ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6、IL-10以及TGF-β水平 收集與HepG2、HepG2.2.15以及重組HBcAg共培養(yǎng)后的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清，1 000 r/min 離心5 min，取上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在450 nm處測(cè)定各組OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1HBV對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞表面極化相關(guān)分子表達(dá)水平的影響 參考文獻(xiàn)[11]將CD86、CCR7作為巨噬細(xì)胞M1型極化的標(biāo)志；將CD163、CD206作為巨噬細(xì)胞M2型極化的標(biāo)志。流式結(jié)果顯示，與HepG2對(duì)照組細(xì)胞相比，同分泌HBV的HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，THP-1巨噬細(xì)胞表面CD86、CCR7表達(dá)水平升高(圖1A)；而CD163、CD206表達(dá)水平?jīng)]有差異(圖1B)。結(jié)果提示，HBV促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞向M1方向極化。

2.2HBcAg對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞表面極化相關(guān)分子表達(dá)水平的影響 流式結(jié)果顯示，10 μg/ml HBcAg刺激后，THP-1巨噬細(xì)胞表面CD86、CD163、CD206表達(dá)較PBS對(duì)照組明顯升高，CCR7無(wú)明顯變化(圖2)。結(jié)果提示，HBcAg主要促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞向M2方向極化，但同時(shí)也促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞CD86分子的表達(dá)。

圖1 THP-1巨噬細(xì)胞分別與HepG2和HepG2.2.15共培養(yǎng)后測(cè)定巨噬細(xì)胞極化相關(guān)表型的變化Fig.1 Changes of phenotypes of macrophages after THP-1 co-cultured with HepG2 and HepG2.2.15 respectivelyNote:Negative/positive gates are classified according to the isotype control.A.Changes of M1 phenotypes of macrophages;B.Changes of M2 phenotypes of macrophages.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2 THP-1巨噬細(xì)胞與HBcAg共培養(yǎng)后測(cè)定巨噬細(xì)胞極化相關(guān)表型的變化Fig.2 Changes of phenotypes of macrophages after THP-1 co-cultured with HBcAgNote:Negative/positive gates are classified according to isotype control.A.Changes of M1 phenotypes of macrophages;B.Changes of M2 phenotypes of macrophages.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

2.3HBV以及HBcAg對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子mRNA表達(dá)的影響 采用RT-qPCR方法驗(yàn)證HBV以及HBcAg對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況。在分別與HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，較HepG2對(duì)照組細(xì)胞而言，與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)的THP-1巨噬細(xì)胞CD86、CCR7的mRNA水平升高；而CD206、CD163的mRNA水平下降(圖3A)。 用10 μg/ml HBcAg作用THP-1巨噬細(xì)胞24 h后，較PBS對(duì)照組而言，THP-1巨噬細(xì)胞的 CD86、CCR7的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化；而CD206、CD163的mRNA表達(dá)水平明顯升高(圖3B)。

2.4HBV對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響 在分別與HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，較HepG2對(duì)照組細(xì)胞而言，與HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)的THP-1巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表達(dá)升高，而TGF-β的mRNA表達(dá)降低(圖4A)；而用ELISA測(cè)定與HepG 2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后的THP-1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6和IL-10的分泌增加，而TGF-β則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4B)。結(jié)果提示，HBV主要促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞分泌促炎因子。

2.5HBcAg對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響 在HBcAg共培養(yǎng)環(huán)境下，測(cè)定THP-1巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS對(duì)照組相比，HBcAg處理組能夠促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞中IL-10、TGF-β以及TNF-α的mRNA表達(dá)水平(圖5A)。收集共培養(yǎng)24 h后THP-1的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TGF-β、IL-10和TNF-α的分泌增加，而IL-6無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5B)。結(jié)果提示，HBcAg主要促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子，但同時(shí)也使部分促炎因子(如TNF-α)表達(dá)升高。

圖3 THP-1巨噬細(xì)胞分別與HepG2/HepG2.2.15(A)以及HBcAg(B)共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞極化相關(guān)表型的mRNA表達(dá)水平的變化Fig.3 mRNA expression level of phenotypes after THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15(A) and HBcAg(B) respectivelyNote:A.mRNA expression level of M1 or M2 phenotypes when co-cultured with HepG2/HepG2.2.15;B.mRNA expression level of M1 or M2 phenotypes when co-cultured with HBcAg.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001,****.P<0.000 1.

圖4 THP-1巨噬細(xì)胞分別與HepG2/HepG2.2.15共培養(yǎng)后相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)(A)以及細(xì)胞因子分泌水平(B)的變化Fig.4 mRNA expression(A) and secretion level(B) of cytokines after THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 respectivelyNote:A.mRNA expression level of cytokines when co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 for 24 h respectively;B.Changes of cytokines secreted by THP-1 co-cultured with HepG2/HepG2.2.15 for 24 h respectively.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 THP-1巨噬細(xì)胞與HBcAg共培養(yǎng)后相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)(A)以及細(xì)胞因子分泌水平(B)的變化Fig.5 mRNA expression(A) and secretion level(B) of cytokines after THP-1 co-cultured with HBcAgNote:A.mRNA expression level of cytokines when co-cultured with HBcAg for 24 h;B.Changes of cytokine secreted by THP-1 co-cultured with HBcAg for 24 h.n=3.*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001,****.P<0.0001.

3 討論

乙肝病毒被認(rèn)為是一種“隱匿性病毒(stealth virus)”，感染HBV后機(jī)體損傷主要是因?yàn)椴《舅T發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)所引起，而非病毒對(duì)肝細(xì)胞的直接破壞[1,12]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫反應(yīng)不僅在HBV感染的病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用，在病程的慢性化過(guò)程中也有舉足輕重的影響，而巨噬細(xì)胞作為重要的固有免疫細(xì)胞，在慢性乙肝感染中的作用日益凸顯[13]。

由于巨噬細(xì)胞存在高度的異質(zhì)性，它的極化與其功能有著密切關(guān)系，然而在慢性乙肝感染中，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)與功能存在著諸多矛盾觀點(diǎn)。一方面，肝臟的枯否細(xì)胞主要表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志，可通過(guò)分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子或上調(diào)抑制性受體PD-1的表達(dá)介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能耗竭，從而抑制機(jī)體抗病毒免疫效應(yīng)[10,14,15]，這種免疫耐受狀態(tài)能夠保護(hù)機(jī)體免受免疫炎癥的損傷，但也促進(jìn)了乙肝病毒的免疫逃逸。有研究者將HBV耐受的小鼠體內(nèi)枯否細(xì)胞清除后，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，處于免疫耐受狀態(tài)的小鼠抗病毒免疫得以恢復(fù)，并逐步清除了 HBV病毒感染[16]。另一方面，有報(bào)道稱在感染HBV后，外周血中Ly6Chi單核細(xì)胞能夠遷移至肝臟并分化為促炎的M1型巨噬細(xì)胞，釋放炎癥因子，從而促進(jìn)HBV清除，發(fā)揮重要的抗病毒作用[17,18]。在急性HBV感染中，巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎作用清除病毒，然而，在慢性HBV感染中，為了維持免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，防止過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)肝臟的損傷，巨噬細(xì)胞更趨向于向M2方向極化[6,18]。與既往研究類似，我們的研究結(jié)果表明，用含有HBV病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激巨噬細(xì)胞后，能夠促進(jìn)其向促炎的M1方向極化并釋放大量炎癥因子，這提示HBV病毒感染能夠激活巨噬細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)[7]。

為了進(jìn)一步闡述巨噬細(xì)胞在慢性乙肝中的極化狀態(tài)和功能，越來(lái)越多的研究著眼于HBV相關(guān)抗原的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，HBsAg和HBeAg能夠抑制巨噬細(xì)胞上TLR所介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)，削弱巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而使HBV逃脫免疫清除[4,19]。但目前為止，針對(duì)慢性乙肝感染中HBcAg對(duì)巨噬細(xì)胞的功能和表型的影響尚存在一定爭(zhēng)議。HBcAg分子量為21 kD，它包裹HBV的前基因組RNA(pgRNA)并形成HBV的核衣殼蛋白[20]，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HBcAg可通過(guò)TLR2通路來(lái)促進(jìn)KCs分泌抑炎因子IL-10并導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭從而介導(dǎo)乙肝的免疫耐受[10]；但近來(lái)有團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，相較轉(zhuǎn)染了攜帶有HBV完整基因質(zhì)粒的小鼠而言，轉(zhuǎn)染HBcAg缺陷的HBV質(zhì)粒的小鼠，其HBV感染持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，提示HBcAg的缺失可能限制了免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的清除[16,21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HBcAg對(duì)巨噬細(xì)胞的影響十分復(fù)雜。一方面HBcAg刺激能夠使得部分巨噬細(xì)胞向抗炎的M2方向極化，并分泌抑炎因子(如TGF-β、IL-10等)導(dǎo)致免疫耐受；另一方面也能夠促進(jìn)部分巨噬細(xì)胞分泌促炎因子(如TNF-α)導(dǎo)致病毒清除。HBcAg對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞極化和功能的復(fù)雜影響，反映了巨噬細(xì)胞在HBV慢性感染中的抗炎/促炎的“雙刃劍”作用，同時(shí)也說(shuō)明了乙肝慢性感染機(jī)制的復(fù)雜性。此外，考慮到不同個(gè)體表現(xiàn)出的巨噬細(xì)胞異質(zhì)性可能對(duì)乙肝病毒及乙肝相關(guān)抗原存在不同反應(yīng)性，并最終導(dǎo)致疾病轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的差異，針對(duì)HBcAg對(duì)巨噬細(xì)胞的極化和功能的影響尚需納入更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)比較HBV和HBcAg對(duì)巨噬細(xì)胞表型和功能的影響，我們發(fā)現(xiàn)HBV能夠使巨噬細(xì)胞向M1型方向極化，而HBcAg的作用主要促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，同時(shí)也上調(diào)CD86和TNF-α等M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)。這種對(duì)巨噬細(xì)胞極化和功能的差異效應(yīng)可能在乙肝慢性化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，值得未來(lái)進(jìn)一步的探索研究。