譚 林 王 騫 陳維順 艾瓊嘉 劉敏姬 胡洪賽 屈偉明

作者單位：412007 株洲 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院消化內科

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，2013年數(shù)據(jù)顯示我國胃癌新發(fā)病例約43萬例，發(fā)病率排在全部惡性腫瘤的第3位［1］。目前，盡管胃癌的診斷和治療均取得了一定進展，但預后仍不理想，其中胃癌發(fā)生侵襲轉移是導致患者死亡的重要原因。因此，亟需尋找特異性的預后預測及治療靶點。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是促進腫瘤侵襲轉移的關鍵步驟，研究顯示上皮細胞表型蛋白E-鈣粘蛋白（E-cadherin）表達下調可導致EMT發(fā)生［2-4］。富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯(lián)受體5（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5）是一種表達于多種正常細胞及腫瘤細胞表面的膜蛋白，可通過激活Wnt/β-catenin信號通路誘導EMT，促進胃癌細胞侵襲遷移［5］。然而，LGR5和E-cadherin在胃癌中的表達及其與預后的關系尚未清楚。本研究通過檢測LGR5和E-cadherin在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，分析兩者與臨床病理特征及預后的關系，為尋找胃癌新的生物學標志物提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年8月—2016年5月在中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院胃癌根治手術切除的癌組織標本115例及相應的癌旁正常組織標本20例（均為手術切緣，病理證實無癌浸潤），其中男性82例，年齡35～86歲（平均年齡61.0歲）。納入標準：⑴經(jīng)病理診斷為胃癌；⑵術前未行化療及放療；⑶順利行胃癌根治術；⑷臨床及病理資料完整，可追蹤隨訪。排除標準：⑴合并其他惡性腫瘤者；⑵有嚴重心、肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴重基礎疾病者。組織標本獲取和使用經(jīng)本院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測胃癌組織LGR5和E-cadherin的表達

兔抗人LGR5多克隆抗體（ab75732）購自英國Abcam公司；鼠抗人E-cadherin單克隆抗（MAB-0738）購自福州邁新公司。所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫水、透明、浸蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片，按照SP法進行免疫組化染色。高倍鏡視野（×200）下每片隨機選擇5個視野進行拍照觀察。結果判斷：由病理科醫(yī)師雙盲閱片，以細胞膜、細胞質、細胞核中出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒視為免疫組化染色陽性。免疫組化計分包括染色強度及陽性細胞比例確定。按染色強度分級：無染色或與背景一致的淺黃色記0分，黃色記1分，棕黃色記2分，黃褐色記3分。按陽性細胞比例分級：陽性細胞數(shù)＜5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，＞50%計3分。每張切片得分由染色強度評分與陽性細胞比例評分相加，0～3分為陰性表達，4～6分為陽性表達。

1.3 隨訪

采用門診或電話定期隨訪，自患者手術當天起每半年隨訪1次，隨訪截至2019年9月，以患者死亡、失訪或最后隨訪時間為終點，隨訪內容主要為患者生存情況。中位隨訪時間為36個月，隨訪期間死亡60例?？偵嫫诙x為自患者入組開始至因任何原因死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。LGR5和E-cadherin在癌組織和癌旁正常組織中表達的差異及其與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗或校正χ2檢驗；LGR5與E-cadherin表達相關性采用Spearman檢驗；采用Kaplan-Meier法計算生存率、組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型分析LGR5、E-cadherin與預后的關系。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織及癌旁正常組織中LGR5和E-cadherin的表達

LGR5主要表達于細胞質，在胃癌組織中陽性率為62.6%（72/115），其中有轉移胃癌組織中的陽性率為78.9%（56/71），無轉移胃癌組織中的陽性率為36.4%（16/44）；在癌旁正常組織中的陽性率為35.0%（7/20）。胃癌組織與癌旁正常組織、有轉移胃癌組織與無轉移胃癌組織組的LGR5陽性表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=25.573，P＜0.001；χ2=20.969，P＜0.001）。

E-cadherin主要表達于細胞質與細胞膜，在胃癌組織中陽性率為53.9%（62/115），其中有轉移胃癌組織中的陽性率為32.4%（23/71），無轉移胃癌組織中的陽性率為88.6%（39/44）；癌旁正常組織中的陽性率為100.0%（20/20）。胃癌組織與癌旁正常組織、有轉移胃癌組織與無轉移胃癌組織的E-cadherin陽性表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=44.829，P＜0.001；χ2=34.583，P＜0.001）。見圖 1。

圖1 LGR5和E-cadherin在胃癌及癌旁正常組織中的表達（SP×200）Fig.1 Expression of LGR5 and E-cadherin in gastric cancer tissues and adjacent normal tissues（SP×200）

2.2 LGR5和E-cadherin的表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關系

LGR5表達與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移有關（P＜0.05）；E-cadherin的表達與腫瘤大小、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移及遠處轉移有關（P＜0.05）。見表1。

2.3 胃癌組織中LGR5表達與E-cadherin表達的關系

Spearman相關性分析結果顯示，在胃癌組織中，LGR5與 E-cadherin的表達呈負相關（r=-0.318，P=0.001）。見表2。

2.4 LGR5和E-cadherin表達與預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，LGR5陽性表達組1年、3年總生存率及中位生存時間分別為63.9%、38.9%、21個月，LGR5陰性表達組分別為88.4%、69.8%、36個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。E-cadherin陰性表達組1年、3年總生存率及中位生存時間分別為56.6%、30.2%、36個月，E-cadherin陽性表達組分別為87.1%、67.7%、15個月，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖2。

單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、LGR5表達陽性和E-cadherin表達陰性與預后有關（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、遠處轉移、LGR5表達陽性及E-cadherin表達陰性是影響預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表1 LGR5和E-cadherin在胃癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)的關系Tab.1 Relationship between the expression of LGR5，E-cadherin and the clinicopathological characteristics of gastric cancer tissues

表2 LGR5與E-cadherin在胃癌組織中表達的Spearman相關性分析Tab.2 Spearman correlation analysis of the expression of LGR5 and E-cadherin in gastric cancer tissues

圖2 LGR5和E-cadherin陽性表達與陰性表達胃癌患者的生存曲線Fig.2 Survival curves of gastric cancer patients with LGR5 and E-cadherin positive expression and negative expression

3 討論

LGR5是G蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質亞家族中的一員，由富含18個亮氨酸的重復單位和7個跨膜區(qū)域組成。LGR5陽性表達的細胞具有某些干細胞特征，可表達于正常組織和腫瘤組織，在食管腺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織中呈彌漫性過表達［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，LGR5在胃癌中的表達高于癌旁正常組織，且主要在有轉移的胃癌組織中表達，提示LGR5在胃癌中可能發(fā)揮促癌作用，與國內文獻報道基本一致［8-9］。進一步的臨床分析顯示LGR5在分化程度低、浸潤程度深、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、合并淋巴結轉移或遠處轉移患者中高表達，提示LGR5高表達可能與腫瘤進展相關，表達量越高，腫瘤越易發(fā)生侵襲轉移。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示，LGR5表達陽性患者的生存率明顯低于LGR5表達陰性患者，多因素Cox回歸分析亦發(fā)現(xiàn)LGR5高表達是影響胃癌患者總生存期的獨立危險因素，說明LGR5高表達提示患者預后不良。WANG等［10］研究也發(fā)現(xiàn)，過表達LGR5與結直腸癌不良預后相關。其可能機制為LGR5與配體R-脊椎蛋白（R-spodin）結合后，可以中和Rnf43/Znrf3的降解信號，從而活化 Wnt/βcatenin信號通路參與腫瘤的EMT過程，進而促進腫瘤侵襲轉移，最終導致患者預后不良［11］。

表3 影響胃癌患者預后的Cox回歸分析Tab.3 Cox regression analysis of prognosis in gastric cancer patients

E-cadherin是一種依賴Ca2+的黏附分子，通過β-catenin等與肌動蛋白纖維相連形成并穩(wěn)定細胞間連接；E-cadherin的缺失是EMT的最重要的標志性變化，也是上皮腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉移的前提條件［12］。研究證明EMT在包括胃癌在內的多種上皮源性腫瘤侵襲和早期轉移中起決定性作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在胃癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，且在轉移組織中的表達低于無轉移的胃癌組織，同時E-cadherin在浸潤程度深、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移或遠處轉移患者中低表達，且E-cadherin陰性表達患者術后總生存期低于陽性表達患者，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin是影響患者總生存的獨立因素，說明E-cadherin與胃癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移密切相關，且E-cadherin低表達提示患者預后不良，與現(xiàn)有文獻［15-16］報道基本一致。

本研究進一步分析LGR5與E-cadherin表達的相關性，發(fā)現(xiàn)兩者呈負相關。既往有研究發(fā)現(xiàn)，LGR5在胃癌組織中表達明顯上調，且與EMT誘導因子PRRX1、TWIST1和BMI1的表達密切相關，在胃癌細胞中LGR5可通過激活TWIST1下調E-cadherin表達，從而誘導EMT的發(fā)生，促進細胞侵襲轉移［17］。故推測LGR5可能通過影響E-cadherin的表達促進EMT發(fā)生，最終導致胃癌侵襲轉移及不良預后。

綜上所述，LGR5在胃癌中高表達，且與患者不良預后有關，可能通過下調E-cadherin的表達而促進EMT發(fā)生實現(xiàn)。LGR5有望作為評估患者預后、監(jiān)測術后腫瘤侵襲轉移的分子標志物及診療的新靶點。但本研究為單中心回顧性研究，且納入臨床樣本量有限，有關結論尚需多中心大樣本研究加以證實。