潛 力 符翠莉 李錫明 黃桂海 林俊浩 李 偉

作者單位：530021 南寧 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院1藥學(xué)部；2泌尿外科

我國前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病率由1988年的1.96/10萬升至2015年的60.3/1 000［1-3］。傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療可暫時(shí)緩解中晚期患者癥狀，但幾乎所有患者均不可避免要經(jīng)歷去勢(shì)抵抗性前列腺癌階段，以阿比特龍和恩扎盧胺為代表的新型內(nèi)分泌藥物雖然可在一定程度上延緩去勢(shì)抵抗性前列腺癌進(jìn)展，但總體療效仍不理想［4-6］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是由結(jié)締組織細(xì)胞分泌，依賴鋅離子的內(nèi)肽酶基因家族，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［7-8］，其重要成員MMP-2和MMP-9在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用［9］。SB-3CT是MMP-2和MMP-9強(qiáng)有力的抑制劑，目前研究顯示SB-3CT可通過降低瘤體內(nèi)血管密度和骨質(zhì)降解從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤［10］。以多西他賽為基礎(chǔ)的化療是治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌的首選方案，但多西他賽單藥并不能有效控制疾病進(jìn)展［11］。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽對(duì)體外培養(yǎng)的前列腺癌PC-3細(xì)胞生長具有顯著的抑制作用［12］，為進(jìn)一步證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽的聯(lián)合用藥療效，本研究在此基礎(chǔ)上建立了人PC-3前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，觀察其對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響，并初步探索潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

人前列腺癌細(xì)胞PC-3購于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細(xì)胞80%融合度達(dá)80%時(shí)傳代，置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SPF級(jí)Balb/c Nude小鼠15只購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，4～6周齡，20～25 g，雄性。飼養(yǎng)于SPF室超凈層流架內(nèi)，動(dòng)物房12 h-12 h晝夜交替，自由飲水、進(jìn)食，溫度23～25℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；SB-3CT、多西他賽購自美國Sigma公司；兔抗人PDK1單克隆抗體、兔抗人PFKFB4單克隆抗體和HRP的二抗均購自美國Abcam公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合倫理要求。

1.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組

取對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞制成濃度為6×107/mL的細(xì)胞懸液，并于裸鼠右腋部位皮下接種150 μL。皮下接種1周后觀察成瘤情況及裸鼠生長狀況，待長出腫瘤后，每隔2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長徑、短徑并計(jì)算腫瘤體積（腫瘤體積=長徑×短徑2/2），繪制腫瘤生長曲線。待移植瘤體積達(dá)100mm3時(shí)按不同分組進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)分為3組：SB-3CT組裸鼠5只，瘤體注射SB-3CT溶液25 mg/kg，每周3次，連續(xù)4周；聯(lián)合用藥組裸鼠5只，在瘤體注射SB-3CT的基礎(chǔ)上靜脈注射多西他賽溶液10 mg/kg，每周1次，連續(xù)4周；空白對(duì)照組裸鼠5只，瘤體注射等量生理鹽水。給藥5周結(jié)束后，裸鼠用3.5%水合氯醛（10 mL/g）麻醉，脫頸處死，剝離腫瘤組織，稱重，PBS緩沖液洗凈，4%多聚甲醛固定。

1.3 免疫組化檢測(cè)裸鼠移植瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達(dá)

組織經(jīng)脫水包埋，4 μm連續(xù)切片后，按照SP法進(jìn)行免疫組化染色。采用免疫組化評(píng)分評(píng)估PDK1和PFKFB4的表達(dá)量。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性細(xì)胞比例0、1%～10%、11%～50%、51%～80%、81%～100%分別計(jì)為0分、1分、2分、3分、4分；再按染色強(qiáng)度無、弱、中、強(qiáng)分別計(jì)為0分、1分、2分、3分，最終評(píng)分為兩個(gè)指標(biāo)的乘積［13］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著差異法（LSD法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般狀況

3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下注射細(xì)胞懸液2周左右于皮下均可觸及瘤體結(jié)節(jié)，成瘤率為100%。實(shí)驗(yàn)期間瘤塊持續(xù)生長，多為圓形或橢圓形，大小較均勻。連續(xù)給藥4周，各組裸鼠藥物耐受性良好，未出現(xiàn)死亡情況。相對(duì)于空白對(duì)照組和SB-3CT組，聯(lián)合用藥組瘤塊體積生長較緩慢。

2.2 SB-3CT對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響

空白對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量為（1.34±0.05）g，SB-3CT組平均瘤體質(zhì)量為（1.08±0.13）g，聯(lián)合用藥組平均瘤體質(zhì)量為（0.88±0.08）g，3組平均瘤體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.556，P=0.001），且聯(lián)合用藥組低于SB-3CT組（P=0.006）。與空白對(duì)照組和SB-3CT組相比，聯(lián)合用藥組腫瘤生長速度明顯緩慢，見圖1。

圖1 裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.1 Growth curves of nude mice xenograft

2.3 裸鼠移植瘤腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達(dá)

顯微鏡下觀察各組裸鼠離體腫瘤組織，可見細(xì)胞異型性明顯，排列紊亂，核仁濃染，分裂相增多，符合惡性腫瘤組織特征。

PDK1在空白對(duì)照組腫瘤組織內(nèi)染色呈片狀，中等強(qiáng)度著色，陽性物質(zhì)呈棕褐色或棕黃色，位于胞漿，組織間結(jié)締組織可見強(qiáng)弱不等的非特異性染色；SB-3CT組和聯(lián)合用藥組染色陽性區(qū)域范圍較空白對(duì)照組減少，染色強(qiáng)度偏弱，見圖2。免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組、空白對(duì)照組和SB-3CT組的染色評(píng)分分別為（2.33±0.47）分、（6.00±0.81）分和（4.33±0.48）分，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.200，P=0.003），且聯(lián)合用藥組評(píng)分低于SB-3CT組（P=0.017）。

PFKFB4在空白對(duì)照組和聯(lián)合用藥組均明顯表達(dá)，陽性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，空白對(duì)照組大部分區(qū)域呈強(qiáng)陽性表達(dá)，聯(lián)合用藥組表達(dá)總體呈中等強(qiáng)度染色，染色陽性比例低于空白對(duì)照組，見圖2。免疫組化結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組、空白對(duì)照組和SB-3CT組的染色評(píng)分分別為（5.33±0.49）分、（11.33±0.47）分和（9.00±1.41）分，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.643，P=0.003），且聯(lián)合用藥組評(píng)分低于SB-3CT組（P=0.011）。

圖2 免疫組化檢測(cè)PDK1和PFKFB4在裸鼠移植瘤組織中的表達(dá)（SP染色）Fig.2 Expression of PDK1 and PFKFB4 in nude mice xenografts detected by immunohistochemical staining（SP staining）

3 討論

既往研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可有效抑制MMP-9高表達(dá)的T細(xì)胞淋巴瘤肝轉(zhuǎn)移［14］。SB-3CT在體內(nèi)具有抑制明膠酶活性作用，通過降低腫瘤血管化和血管生成可抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤［10］。前列腺癌組織普遍存在MMP-9高表達(dá)，且其表達(dá)程度與臨床病理分期呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)［15-16］，提示MMP-9高表達(dá)可能在前列腺癌侵襲和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，而以MMP-9為靶點(diǎn)的藥物已用于臨床治療前列腺癌［17］。多西他賽化療雖然是目前治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌的一線方案，但單藥治療效果欠佳。一項(xiàng)來自歐洲的單中心研究顯示［11］，多西他賽治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者，經(jīng)過平均1.6年的隨訪，94.1%的患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展并導(dǎo)致68.6%的患者死亡。本團(tuán)隊(duì)前期的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT可抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的存活，且10.0 μmol/L的SB-3CT濃度即可達(dá)到明顯的抑制作用，28.8 μmol/L為半數(shù)抑制濃度，藥物協(xié)同指數(shù)顯示多西他賽與SB-3CT在體外具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，與多西他賽單藥相比，聯(lián)合用藥對(duì)體外培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞存活具有更顯著的抑制作用［12］。本研究構(gòu)建前列腺癌裸鼠移植瘤模型，進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合應(yīng)用多西他賽和SB-3CT可降低裸鼠移植瘤的質(zhì)量，生長曲線顯示SB-3CT單藥和多西他賽聯(lián)合用藥均可降低裸鼠移植瘤生長速度，且與SB-3CT單藥相比，聯(lián)合用藥具有更強(qiáng)的抑制作用，與前期體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的糖代謝特點(diǎn)，大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞存在高代謝特征，特別是惡性腫瘤細(xì)胞的分裂增殖較正常細(xì)胞快，能量消耗相應(yīng)增加，因此癌細(xì)胞的異常過度增殖常伴隨葡萄糖過度消耗。近年來，隨著氟代脫氧葡萄糖－正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（FDG-PET）的廣泛臨床應(yīng)用，腫瘤細(xì)胞的糖代謝變化成為研究熱點(diǎn)?！澳芰看x異?！币驯还J(rèn)為腫瘤細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志性特征［18-19］。PDK1和PFKFB4是細(xì)胞糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，本團(tuán)隊(duì)前期采用shRNA沉默前列腺癌PC-3細(xì)胞中PDK1和PFKFB4基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PDK1和PFKFB4基因表達(dá)降低具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT可顯著降低體外培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞的葡萄糖消耗量，抑制細(xì)胞內(nèi)PDK1和PFKFB4基因表達(dá)和提高細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，這可能是SB-3CT發(fā)揮其作用的潛在分子機(jī)制［20］。本研究是前期細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的進(jìn)一步延續(xù)，剝離裸鼠移植瘤后，采用免疫組化檢測(cè)各組裸鼠離體腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥亦可降低腫瘤組織內(nèi)PDK1和PFKFB4的表達(dá)，與前期的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT聯(lián)合多西他賽較SB-3CT單藥可在體內(nèi)進(jìn)一步降低PDK1和PFKFB4的表達(dá)，繼而可能通過降低腫瘤組織的糖代謝活性，從而發(fā)揮抑制前列腺癌移植瘤生長的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽聯(lián)合基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT對(duì)前列腺癌裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且可能通過降低腫瘤組織中PDK1和PFKFB4的表達(dá)而影響糖代謝活性實(shí)現(xiàn)，多西他賽聯(lián)合SB-3CT有望成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌治療的新方案。