賴智勇 胡嘉欣 李枝鍵李天宇 謝遠亮 王秋雁

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學基因組與個體化醫(yī)學研究中心；2廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科；3廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，2018年全球約有54.9萬例新發(fā)病例和20萬例死亡病例［1］。膀胱癌具有多中心、易復(fù)發(fā)及浸潤性生長等特點［2］，目前越來越多的證據(jù)表明膀胱癌是一組分子異質(zhì)性疾?。?-4］。腫瘤異質(zhì)性是影響治療效果的主要因素之一［5］。因此，對膀胱癌異質(zhì)性進行研究，分析不同患者疾病特點，有助于提供個性化治療。單細胞技術(shù)可通過分析腫瘤微環(huán)境中細胞亞群的多樣性及進化關(guān)系實現(xiàn)對腫瘤異質(zhì)性研究［6］。作為單細胞理論的一種代表性應(yīng)用，單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)（single-cell mass cytometry，CyTOF）采用金屬同位素標記抗體，克服了傳統(tǒng)流式通道間發(fā)射光譜信號重疊帶來的影響，且可同時對單個細胞中多達40種參數(shù)進行檢測，實現(xiàn)對細胞亞群的精確分析［7］。自從實現(xiàn)對人外周血細胞組分檢測以來［8］，CyTOF 在腎癌［9］、肺腺癌［10］、乳腺癌［11］等多種實體腫瘤的異質(zhì)性分析中發(fā)揮了重要作用。本研究采用CyTOF對膀胱癌及癌旁組織的浸潤性免疫細胞進行分群，并比較免疫細胞組成的差異，以期為膀胱癌的精準治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年12月—2019年3月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行膀胱癌根治術(shù)的患者為研究對象，收集其癌組織及其癌旁組織（距離腫瘤邊緣2 cm）。納入標準：⑴術(shù)后病理確診為膀胱癌；⑵術(shù)前未接受免疫治療、靶向治療及放化療。排除標準：⑴術(shù)前行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)者；⑵根治術(shù)后膀胱解剖提示組織壞死嚴重者；⑶膀胱腫瘤多發(fā)，未取得癌旁組織者。共4例患者符合標準納入研究，臨床病理資料見表1。本研究通過廣西醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、FBS特級血清購自北京Cellmax公司；膠原酶I購自美國Gibco公司；臺盼藍染液、紅細胞裂解液及HBSS平衡液及青/鏈霉素雙抗混合液均購自北京索萊寶科技有限公司；Dnasel、DMSO均購自美國Sigma-Aldrich公司；Fc受體封閉溶液購自美國Biolegend公司；抗體穩(wěn)定緩沖液購自德國Candor Bioscience公司；MaxPar抗體標記試劑盒、順鉑、鑭系金屬標簽、EQTM四元素校準磁珠、Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細胞儀均購自美國Fluidigm公司；MACSmixTM組織混懸儀、GentleMACS組織解離器均購自德國Miltenyi公司。

表1 膀胱癌患者的臨床病理資料Tab.1 Clinicopathological characteristics in patients with bladder cancer

1.3 實驗方法

1.3.1 單細胞懸液的制備 取新鮮膀胱癌組織及其癌旁組織，剪碎后轉(zhuǎn)移至C管，加入膠原酶Ⅰ溶液（每l mL HBSS 加入 2 mg膠原酶Ⅰ和 20 μg DNaseI），置于gentleMACS組織處理器上解離。然后置于混懸儀上，37℃孵育，至無明顯塊狀。于70 μm細胞濾器冰上過濾組織懸液，4℃離心后棄上清液。冰上裂解紅細胞，加入預(yù)冷PBS重懸洗滌。按體積比1∶9將DMSO、FBS配制成凍存液，-80℃保存。

1.3.2 鑭系金屬探針標記 向管內(nèi)加入95 μL L-Buffer重懸polymer，加入鑭系金屬溶液混勻，37℃水浴。50 kDa 超濾管中加入 100 μg 抗體和 400 μL R-Buffer，12 000×g，離心棄濾液。稀釋TCEP至4 mmol/L。超濾管中加入TCEP-R-Buffer，混勻后37℃水浴30 min。取3 kDa超濾管，加入200 μL L-Buffer以及metal-loaded polymer混合物，離心，棄濾液。柱中加入400μL C-Buffer，離心，棄濾液。取出50kDa超濾管，加入300μLC-Buffer，離心，棄濾液。取出3 kDa超濾管和50 kDa超濾管后棄濾液，3 kDa超濾管中加入C-Buffer，重懸metalloaded polymer，轉(zhuǎn)移至50 kDa超濾管中吹打混勻，37℃孵育90 min。取出濾管，抗體混合液中加入W-Buffer，離心后清洗 3次，管內(nèi)加入80 μL W-Buffer，混勻，檢測抗體濃度，離心后加入抗體穩(wěn)定液，再次離心，-20℃保存。

1.3.3 細胞表面抗體標記 37℃下快速復(fù)蘇細胞，離心去除DMSO后加入完全培養(yǎng)基重懸。稀釋懸液后取少量用于臺盼藍染色，計數(shù)后留取150萬細胞，PBS重懸。按1∶10 000比例配制Cisplatin，每管加入1 mL，避光孵育5 min，4℃離心，加入細胞染色緩沖液（CSB）后離心。按1∶50配制Fc受體阻斷劑，每管加入50 μL，孵育10 min。每管加入50 μL抗體混合物，孵育1 h后加入CSB清洗，離心后棄上清液。按1∶4配制核抗原染色緩沖液工作溶液，每管加入1 mL，孵育30 min后加入2 mL核抗原染色滲透液，離心棄上清液。每管加入1 mL 1.6%甲醛工作液固定，孵育10 min，離心棄上清液。每管加入Ir工作液（1∶1 000），混勻后4℃過夜。取出樣本，加入CSB及ddH20清洗。每管加入10%EQTM四元素校準磁珠溶液，重懸細胞，4℃保存，待上機檢測。

1.3.4 CyTOF質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 采用Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細胞儀檢測樣品中腫瘤浸潤性免疫細胞26種免疫相關(guān)標志物的表達。采集流式數(shù)據(jù)后，導(dǎo)入CyTOF軟件（v6.7）進行歸一化合并。于Cytobank云平臺（https：//www.cytobank.org/）分析流式細胞實驗標準文件（FCS）數(shù)據(jù)。通過t分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）算法生成t-SNE圖，對CD45+細胞進行聚類，分析不同細胞亞群表型及相對含量的差異。實驗及數(shù)據(jù)分析流程如圖1所示。

圖1 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析流程Fig.1 Experimental design and data analysis flow

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。鑒于本研究中的樣本量過少（n=4），故根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點，選擇配對樣本t檢驗的Bootstrap法比較膀胱癌組織和癌旁組織兩組數(shù)據(jù)中各類細胞亞群之間的差異。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱腫瘤微環(huán)境免疫細胞亞群分布

根據(jù)門控圈取的20 000個CD45+免疫細胞上主要免疫標志物的表達水平，將其分成7個CD4+T細胞簇（CD3e+、CD4+、CD45RO+），即亞群 01、03、05、07、10、11、22；8 個 CD8+T 細胞簇（CD3e+、CD8a+），即亞 群 02、04、08、13、16、17、21、25；4 個 巨 噬 細 胞 簇（CD3e-、CD11c+、CD14+、CD38+、CD45RO+、HLA-DR+），即亞群 06、12、18、23；2 個 B 細胞簇（CD3e-、CD19+、CD20+、CD45RA+、HLA-DR+），即亞群 09、14；1 個樹突狀細胞簇 （CD3e-、CD38+、CD45RO+、HLA-DR+），即亞群24和3個其他類型免疫細胞（15、19、20），見圖2A～B。聚類分析結(jié)果顯示這些細胞亞群具有多樣性，見圖2C。

圖2 膀胱腫瘤微環(huán)境免疫概況Fig.2 Overview of bladder cancer microenvironmental immunity

2.2 膀胱癌組織與癌旁組織中免疫細胞亞群的差異性

基于細胞表型間的相似性，本研究將癌組織與癌旁組織中CD45+細胞分為13類主要免疫細胞，分別為B細胞、巨噬細胞（macrophages）、樹突狀細胞（dendritic cells）、自然殺傷細胞（NK cells）、CD8+幼稚T細胞（CD8+T naive）、CD8+中樞記憶 T細胞（CD8+TCM）、CD8+有效記憶 T 細胞（CD8+TEM）、CD8+終末分化效應(yīng)記憶T細胞（CD8+TEMRA）、CD4+Treg細胞、CD4+幼稚 T 細胞（CD4+T naive）、CD4+TCM、CD4+TEM、CD4+TEMRA，其在癌組織及癌旁組織中的分布特點見圖3A。根據(jù)這些細胞表達抗體標記的差異性，進一步將其手工標記細分為18個免疫細胞亞群，包括CD4+T（CD4+Treg細胞、CD4+T naive、CD4+TCM、CD4+TEM、CD4+TEMRA），CD8+T（CD8+T naive、CD8+TCM、CD8+TEM、CD8+TEMRA），DP，DN 等 11 個 T 細胞亞群以及B細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞，自然殺傷細胞，CD14-HLA-DR+，CD14-HLA-DR-，CD19-CD3-。通過Sunburst圖呈現(xiàn)這18個免疫細胞亞群在CD45+細胞中的占比（圖3B），發(fā)現(xiàn)T細胞的占比最大，在癌組織和癌旁組織中的平均占比分別為76.73%、47.60%；其次為B細胞，在癌組織和癌旁組織中平均占比分別為6.34%、15.20%；巨噬細胞在癌組織和癌旁組織中占比分別為8.84%、23.82%。將4例患者數(shù)據(jù)合并后計算發(fā)現(xiàn)，CD4+Treg細胞在癌旁組織中平均占比為0.81%，在癌組織中為2.20%，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.016），而其他類型免疫細胞的所占比例組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖 3B～C。

圖3 膀胱癌組織與癌旁組織免疫細胞亞群之間的差異Fig.3 Difference in immune cell subpopulations between bladder cancer tissues and paracancerous tissues

3 討論

免疫治療在腫瘤治療中取得了較大進展，目前主要的免疫檢查點抑制劑PD-1/PD-L1為多種實體腫瘤患者帶來了長期的生存獲益［12-14］，但是客觀有效率僅為10%～30%［12］。膀胱癌診斷主要依靠組織學和免疫組織化學染色，但因存在組織學變異，不同患者預(yù)后并不同［15］。GALON 等［16］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和總生存時間在很大程度上取決于局部適應(yīng)性免疫反應(yīng)的狀態(tài)，腫瘤樣本中免疫細胞的類型、密度和位置較組織病理學檢查能更好地預(yù)測患者生存。單細胞技術(shù)是目前用于研究腫瘤異質(zhì)性的重要手段［17］，質(zhì)譜流式細胞術(shù)作為其代表應(yīng)用之一，結(jié)合了傳統(tǒng)流式分析方法和質(zhì)譜技術(shù)的雙重優(yōu)點［7］。從方法學上，質(zhì)譜流式技術(shù)能夠區(qū)分不同的細胞亞群，有助于對腫瘤異質(zhì)性分析。

本研究基于CyTOF比較了4例膀胱癌患者癌組織與癌旁組織中的免疫細胞亞群。結(jié)果顯示，采用免疫細胞標志物對細胞進行標記后，可將其分為25個亞群，主要包括8類細胞群：CD4+T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞和其他類型的免疫細胞。同時也得到了每個細胞亞群在CD45+細胞中的占比。其中T細胞是主要的免疫細胞群，在癌組織中占比較大，其次為B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，與CHEVRIER等［9］對腎透明細胞癌的研究結(jié)果相符。T細胞及B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞在癌組織和癌旁組織中的差異表達，提示不同免疫細胞的富集具有一定的組織傾向性。同時這些細胞亞群在不同患者中的占比相差較大，也反映了不同個體間腫瘤免疫微環(huán)境的異質(zhì)性。

CD4+Treg細胞是一類胸腺來源的細胞，具有維持自身耐受，調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)作用［18］。其介導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤免疫逃逸機制之一，也是目前進行腫瘤免疫治療的主要障礙［19-20］。發(fā)生免疫逃逸的腫瘤可通過調(diào)節(jié)腫瘤浸潤性白細胞的募集、擴增和功能，避免被免疫系統(tǒng)檢測和消除［21］。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+Treg細胞比例在膀胱癌組織和癌旁組織中存在差異（2.20%vs 0.81%），盡管其占比較小。在許多人類癌癥中，Tregs細胞的高度浸潤與患者預(yù)后不良有關(guān)［22］。研究證實CD4+Treg細胞與膀胱癌患者的病理分級、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)均呈正相關(guān)［23-25］。因此，本研究認為CD4+Treg細胞在膀胱癌組織中的相對富集，可能介導(dǎo)了膀胱腫瘤對機體的免疫逃逸，因此值得對CD4+Treg細胞群開展更深入的研究，探究其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。

本研究存在以下不足：⑴樣本量較少。因早期診斷的表淺膀胱腫瘤多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療，組織標本體積較小，且經(jīng)過燒灼后細胞活力較低，故該類患者未納入本研究。⑵可用商品化抗體較少。當前質(zhì)譜技術(shù)仍在發(fā)展中，可用的高質(zhì)量免疫細胞抗體數(shù)量相對較少，有待更多高質(zhì)量商品化抗體的推出，以覆蓋對更多免疫細胞表面標志物的檢測。

本研究通過CyTOF實現(xiàn)了對膀胱浸潤性免疫細胞的初步分群，發(fā)現(xiàn)T細胞為膀胱腫瘤微環(huán)境中的主要細胞群，且在癌組織中相對比例更高，而B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞則在癌旁組織中相對更高。CD4+Treg細胞在膀胱癌組織中的相對富集，可能介導(dǎo)了膀胱腫瘤對機體的免疫逃逸。此外，本研究提供了一種通過降維算法t-SNE分析膀胱癌和癌旁浸潤性免疫細胞差異性的方法。希望后續(xù)能夠通過更大且獨立的隊列，分析更多的細胞亞群，為闡明膀胱癌的發(fā)病轉(zhuǎn)移機制提供參考依據(jù)。