王萬鵬 蒯巧林 唐伯玉 王維 梁森林 潘艷 高甄典 李娟

223400 淮安，南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬漣水縣人民醫(yī)院腎臟科(王萬鵬，蒯巧林，唐伯玉，梁森林，高甄典，李娟)，檢驗(yàn)科(王維，潘艷)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生與健康問題[1]。越來越多的基礎(chǔ)及臨床研究表明，無論原發(fā)病如何，蛋白尿均可加速CKD的進(jìn)展。因此蛋白尿是CKD防治工作中重要的靶點(diǎn)，減少蛋白尿的發(fā)生發(fā)展將有助于延緩CKD的進(jìn)展，改善患者預(yù)后。足細(xì)胞損害是引起腎小球性蛋白尿重要的病理因素，與多種腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。臨床常見的原發(fā)性或繼發(fā)性CKD，均伴有不同程度的足細(xì)胞損傷。因此，有關(guān)足細(xì)胞保護(hù)的研究在各型CKD的防治工作中都顯得尤為重要，是CKD早期防治工作的重點(diǎn)[2]。

我們前期的研究中通過芯片篩查證實(shí)狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者中存在miRNA表達(dá)異常，擴(kuò)大樣本驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)異常升高的miR-130b與患者24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)性[3]，但miR-130b在足細(xì)胞損傷中的作用尚不明確。本研究中，我們通過嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)誘導(dǎo)足細(xì)胞體外損傷模型，并使用微小RNA抑制劑(inhibitor)觀察miR-130b在足細(xì)胞損害中的作用以及機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

主要試劑PAN購(gòu)自美國(guó)Sigma，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)。miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、Lipofectamine RNAiMax和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、MiR-130b和內(nèi)參U6特異性探針引物(美國(guó)Life Technologies)；MiR-130b抑制劑和模擬物(mimic/inhibitor)及各自對(duì)照(NC)(廣州瑞博生物有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和Psicheck-2載體(美國(guó)Promega)；過氧化物增殖受體協(xié)同因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC1α)多克隆抗體、突觸足蛋白抗體(Synaptopodin)多克隆抗體(美國(guó)Proteintech)，腎病蛋白(Nephrin)單克隆抗體(美國(guó)abcame)，GAPDH抗體(美國(guó)CST)。胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、PVDF膜及ECL超敏發(fā)光劑(上海碧云天)。條件永生化溫度敏感小鼠足細(xì)胞系MPC5由東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院張光遠(yuǎn)博士饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。

二、方法

1.足細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 足細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，先于33 ℃、10 μg/mL的重組小鼠γ干擾素誘導(dǎo)下增殖，待其長(zhǎng)至約70%～80%融合時(shí)，使用0.05%胰蛋白酶消化細(xì)胞后傳代并置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)10～14 d使其分化成熟。按照Lipofectamine RNAiMax轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分化成熟的足細(xì)胞轉(zhuǎn)染前更換Opti-MEM培養(yǎng)基，按照說明書分別配置A、B液及轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miR-130b inhibitor或?qū)φ?NC)inhibitor(50 nM)。轉(zhuǎn)染6 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)主要分組：(1)PAN組：轉(zhuǎn)染NC inhibitor 6 h后予以溶于二甲基亞砜(DMSO)的PAN(100 μg/mL)干預(yù)24 h；(2)PAN+miR-130b inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor 6 h后予以PAN干預(yù)24 h；(3)DMSO(對(duì)照)組：予以等量DMSO干預(yù)。

2.實(shí)時(shí)定量PCR MiRNA提取步驟按照試劑盒說明書，將總RNA產(chǎn)物溶解于無RNA酶水中。以RNA作為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系5 μL，條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。實(shí)時(shí)定量PCR體系10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。2610318N02Rik實(shí)時(shí)定量PCR，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實(shí)時(shí)定量PCR體系10 μL，引物由上海生工合成，RIK序列為：正5’-CGCCTACCTGGATCTTCCAC-3’，反5’-CCAGACATGGGCTCACCAAT-3’，反應(yīng)條件同上。其中miR-130b檢測(cè)是用U6作為內(nèi)參，RIK基因表達(dá)使用GAPDH作為內(nèi)參。根據(jù)所得CT值，運(yùn)用2-ΔΔCT相對(duì)定量法分別計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

3.足細(xì)胞骨架染色 按照試劑盒說明書使用PBS配置鬼筆環(huán)肽工作液(100 nM)，吸掉培養(yǎng)液，37 ℃預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞2次，0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液溫避光孵育30 min，含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。

4.蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，加入200 μL含1% PMSF的細(xì)胞裂解液，刮取所有細(xì)胞，室溫12 000 rpm離心15 min，進(jìn)行蛋白濃度定量并配成統(tǒng)一濃度。加入1/4體積5×上樣緩沖液，沸水中加熱10 min。以穩(wěn)定電壓100 V轉(zhuǎn)膜100 min，分別加入各種一抗，4 ℃過夜，PBST漂洗15 min，重復(fù)3次。加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育60 min，PBST漂洗3次后用超敏ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。

5.足細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用胰酶消化足細(xì)胞后離心，收集。冷PBS漂洗3次，1 000 g、4 ℃離心5 min。按照Annexin V/PI試劑盒說明書進(jìn)行操作，重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(FITC-Annexin V)和5 μL碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光20 min，使用300目的過濾網(wǎng)過濾后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞分為4個(gè)象限：左下象限為活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡和死亡細(xì)胞，左上象限為機(jī)械損傷細(xì)胞。

6.靶基因驗(yàn)證 通過生物信息學(xué)網(wǎng)站targetscan 7.2在線預(yù)測(cè)出miR-130b與PGC1α mRNA的3端非編碼區(qū)(3’UTR)之間存在保守的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建PGC1α 3’UTR野生型(wt-PGC1α-3’UTR)及結(jié)合位點(diǎn)突變型載體(mut-PGC1α-3’UTR)，分別將miR-130b mimic及其對(duì)照物NC mimic與各載體共轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。本部分實(shí)驗(yàn)共分4組：(1)NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR組；(2)NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR組；(3)miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR組；(4)miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR組。24 h后收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說明，檢測(cè)細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、嘌呤霉素氨基核苷對(duì)PGC1α、miR-130b及宿主基因2610318N02Rik(RIK)表達(dá)的影響

如圖1所示，隨著PAN干預(yù)的濃度增加，足細(xì)胞內(nèi)PGC1α蛋白表達(dá)減少(圖1A)；而miR-130b表達(dá)上升，其中50 μg/mL與100 μg/mL組與對(duì)照組相比，差異均有意義(P<0.05，圖1B)。同時(shí)，相似的表達(dá)趨勢(shì)也見于宿主基因RIK(P<0.05，圖1C)。

二、抑制miR-130b對(duì)于足細(xì)胞裂孔膜蛋白及PGC1α表達(dá)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，PAN組的足細(xì)胞裂孔膜蛋白(synaptopodin和nephrin)及潛在靶基因(PGC1α)的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-130b inhibitor足細(xì)胞組與單純PAN干預(yù)組比較，synaptopodin、nephrin及PGC1α表達(dá)上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、抑制miR-130b對(duì)于足細(xì)胞骨架排列的影響

鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果如圖3所示，PAN組足細(xì)胞骨架出現(xiàn)紊亂、重組以及降解，并向邊緣聚集；與PAN組相比，PAN+miR-130b inhibitor組的足細(xì)胞骨架紊亂明顯好轉(zhuǎn)，在細(xì)胞內(nèi)部可見排列有序的足細(xì)胞骨架。

圖1 嘌呤霉素氨基核苷對(duì)PGC1α、miR-130b及RIK表達(dá)的影響(A.PGC1α蛋白，B.miR-130b，C.RIK基因)；與對(duì)照組比較，aP<0.05

四、抑制miR-130b對(duì)于足細(xì)胞凋亡的影響

各組足細(xì)胞凋亡如圖4所示，與對(duì)照組比較，PAN干預(yù)24 h后可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.78%±0.45% vs 23.67%±3.06%，P<0.01)。PAN+miR-130b inhibitor組與PAN組相比，細(xì)胞凋亡減少(23.67%±3.06% vs 15.47%±1.74%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。

五、miR-130b對(duì)于足細(xì)胞PGC1α表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見圖5A，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miR-130b mimic 24h后可以下調(diào)PGC1α的蛋白表達(dá)(P<0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果見圖5B，miR-130b mimic+wt-PGC1α-3’UTR組與NC mimic+wt-PGC1α-3’UTR組比較，熒光強(qiáng)度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而miR-130b mimic+mut-PGC1α-3’UTR組與NC mimic+mut-PGC1α-3’UTR組比較，熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：與DMSO組比較，aP<0.05；與PAN+miR-130b inhibitor組比較，bP<0.05圖2 抑制miR-130b對(duì)于足細(xì)胞裂孔膜蛋白表達(dá)的影響

圖3 抑制miR-130b對(duì)于足細(xì)胞骨架排列的影響

注：與DMSO組比較，aP<0.05；與PAN+NC inhibitor組比較，bP<0.05圖4 miR-130b對(duì)于足細(xì)胞凋亡的影響

討 論

足細(xì)胞損傷機(jī)制極其復(fù)雜，多種理化、生物因素均可影響足細(xì)胞的功能。近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的研究深入，表觀遺傳缺陷在足細(xì)胞損害中的作用也越來越受到學(xué)界關(guān)注。PAN是嘌呤霉素的衍生物，具有選擇性的腎損害作用，PAN所致的腎臟損傷與人類腎病損傷一致，早期表現(xiàn)為細(xì)胞足突融合和消失的微小病變，隨著PAN作用時(shí)間的延長(zhǎng)和蓄積量的增加，足細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步發(fā)展為局灶節(jié)段性腎小球硬化。而PAN作用的靶細(xì)胞即為足細(xì)胞，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)PAN干預(yù)后足細(xì)胞裂孔膜蛋白表達(dá)降低、骨架重排降解、凋亡增加。而伴隨PAN作用濃度的提高，我們也發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞內(nèi)miR-130b表達(dá)升高，這個(gè)結(jié)果初步提示miR-130b可能參與了PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。而宿主基因RIK的表達(dá)也被證實(shí)伴隨上升(圖1C)，這個(gè)結(jié)果提示，PAN可能可以直接促進(jìn)RIK的轉(zhuǎn)錄而上調(diào)miR-130b的表達(dá)。但具體機(jī)制尚不明了，在未來的研究中我們將繼續(xù)深入。

圖5 PGC1α是miR-130b的靶基因(A.miR-130b對(duì)于足細(xì)胞PGC1α蛋白表達(dá)的影響，與轉(zhuǎn)染NC mimic組比較，aP<0.05；B.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-130b與PGC1α靶向關(guān)系，與其余3組比較，aP<0.05)

目前尚無關(guān)于miR-130b與足細(xì)胞損傷相關(guān)的報(bào)道。已知的miR-130b的功能主要集中在腫瘤生物行為學(xué)、代謝性疾病及衰老的相關(guān)性研究。我們注意到Wang等[4]的研究結(jié)果顯示肥胖小鼠模型和中國(guó)人中循環(huán)miR-130b水平升高，且與身體質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)，與三酰甘油水平相比，是代謝綜合征的一個(gè)更好的預(yù)測(cè)因子；進(jìn)一步研究顯示這些升高的miR-130b能以肌細(xì)胞作為靶點(diǎn)，降低肌細(xì)胞靶基因PGC1α表達(dá)，在肌肉脂肪氧化中起關(guān)鍵作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-130b可以通過抑制腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)而參與腎臟纖維化的進(jìn)展[5]。在本研究中，我們也證實(shí)，隨著PAN作用濃度增加，PGC1α在足細(xì)胞的中的表達(dá)也進(jìn)一步降低(圖1A)，提示升高的miR-130b可能參與了對(duì)于PGC1α的調(diào)節(jié)。

PGC1α與PPARγ都是重要的腎臟保護(hù)因子，并影響機(jī)體與細(xì)胞多種生命活動(dòng)，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡、抗炎反應(yīng)、調(diào)控脂肪、糖代謝、能量平衡，抑制腫瘤血管生成、抗肝纖維化作用、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂和降血壓、改善心功能衰竭等[6-7]。在CKD的研究中，人們發(fā)現(xiàn)PPARγ激動(dòng)劑能夠降低醛固酮誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型腎臟中ET-1、COX-2及TGF-β1的過表達(dá)，發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用[8]。相似的腎臟保護(hù)作用也被證實(shí)存在于小鼠腎缺血/再灌注損傷的模型中[9]。而激活PGC1α也被證明可以減少高糖環(huán)境下引起的足細(xì)胞骨架排列紊亂、表達(dá)減少，進(jìn)一步研究顯示主要通過抑制線粒體自由基合成，改善呼吸鏈復(fù)合物活性，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡通路的激活[10]。在本研究中結(jié)果顯示抑制miR-130b表達(dá)可以有效緩解PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞裂孔膜蛋白下降、細(xì)胞骨架重排及凋亡發(fā)生率，并同時(shí)提高PGC1α表達(dá)。進(jìn)一步通過Western blot及雙熒光素報(bào)告酶系統(tǒng)檢測(cè)證實(shí)miR-130b在足細(xì)胞損傷中的作用可能與其可以抑制PGC1α表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，miR-130b可能通過靶向抑制PGC1α表達(dá)進(jìn)而參與足細(xì)胞的損傷，而抑制miR-130b的表達(dá)對(duì)足細(xì)胞保護(hù)具有積極意義。