何冰倩，程桂林，李桂東，王劍峰?

（1.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院，浙江 杭州 311404；2.杭州胡慶余堂第二門診部，浙江 杭州 310002）

中醫(yī)藥作為中華民族的瑰寶，不僅含有目前偏重研究的有機化合物，同時也含有經常被忽視的Fe、Mn、Cu、Zn、Se、B、Sr 等多種微量元素。中藥中微量元素是決定中藥四性的物質基礎之一，也是中藥有效成分的核心組分［1］。目前隨著對其微量元素的深入研究，不斷發(fā)現(xiàn)某些中藥中的微量元素與其療效存在一定的相關性，如微量元素的種類及含有量［2-4］。

中藥體外預消化可定義為單味中藥材或中藥復方通過煎煮、濃縮、發(fā)酵、賦型（噴霧干燥或冷凍干燥）在體外完成模仿體內消化之全過程。通過模擬人體的胃腸環(huán)境，結合物理消化和生物消化，將不易消化吸收或有毒中藥在人體外進行預消化，從而增加中藥的療效、降低毒性，利于臨床使用。軟堅散結類中藥常用于腫瘤治療，特別是一些介殼和礦石類中藥，這類中藥的傳統(tǒng)炮制法多為高溫煅燒或是采用醋淬法，經高溫煅燒后，中藥中的蛋白或者多糖類成分發(fā)生變性，含有量大大降低，而其所含的微量元素大多比較穩(wěn)定，這些微量元素很可能是中藥發(fā)揮軟堅散結作用的物質基礎。

大部分中藥均以水煎液的形式供患者服用。介殼類中藥中微量元素的存在形態(tài)，以及其溶出率高低受復方配伍及酸度的影響較大［2］。介殼類中藥大多具有平肝潛陽的功效，部分還具有滋陰潛陽、重鎮(zhèn)降逆、軟堅散結、鎮(zhèn)心安神等功效。牡蠣、瓦楞子、蟹殼和鱉甲均具有軟堅散結的作用，研究表明，其治療甲狀腺結節(jié)、甲狀腺腫瘤等相關疾病效果顯著［5-8］。本研究擬對牡蠣、瓦楞子、蟹殼及鱉甲4 種介殼類中藥，通過采用不同的體外預消化方式，提取中藥中的微量元素，并對其進行分析檢測，考察體外預消化方式對微量元素提取效率的差異，以期為提高中藥的療效及質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 iCAP 7000 SERIES 電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；DGG-9240 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；Allegra X-30 Centrifuge 多功能臺式高速離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Milli-Q Direct 8 純水儀（默克密理博公司）；MC-100B 恒溫搖床（上海牟測儀器科技有限公司）；Mettler MS204TS 精密天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；Scientific 1300 系列A2 型二級生物安全柜（美國賽默飛世爾科技公司）；S210-K pH 計（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 材料 牡蠣、瓦楞子（批號170202，170103）購于安徽亳州中藥材市場；蟹殼、鱉甲（批號 161201，161102）購于安徽慶豐堂。藥材經浙江中醫(yī)藥大學藥學院黃真教授鑒定，牡蠣為牡蠣科動物近江牡蠣Ostrea rivularisGould 的貝殼；瓦楞子為蚶科動物毛蚶Arca subcrenataLischke 的貝殼；蟹殼為為弓蟹科動物中華絨螯蟹Eriocheir sinensisH.Milne-Edwards 的甲殼；鱉甲為鱉科動物鱉Trionyx sinensisWiegmann 的背甲。雙魚牌9°米醋（杭州市食品釀造有限公司，批號20170531）；保加利亞乳桿菌CICC6032（上海北諾生物科技有限公司）；牛肉膏（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10086453）；酪蛋白胨（青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司，批號20161012）；無水葡萄糖（上海凌峰化學試劑有限公司，批號20160615）；酵母粉［生工生物工程（上海）股份有限公司，批號CC29BA0010］。檸檬酸氫二銨（上海凌峰化學試劑有限公司，批號20151216）；優(yōu)級純硝酸（批號20131011）、吐溫80（批號20160627）、無水乙酸鈉（批號20170227）、無水磷酸氫二鉀（批號20161112），均購于上海凌峰化學試劑有限公司，七水硫酸鎂（上海滬試實驗室器材股份有限公司，批號20170426）；一水合物硫酸錳（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10086124）；As、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Sb、Se、Ti、V、Zn 對照品溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1 000 μg/mL，16DC341）。

2 方法

2.1 樣品醋提取法 精密稱取各藥材粉末（50 目篩）20 g，分別加入0%（蒸餾水）、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 體積分數(shù)的米醋至60 mL，加熱回流1 h 后，12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，過濾后加超純水定容至100 mL，備用。

另用傳統(tǒng)醋淬法制備樣品，取20 g 各藥材粉末置于坩堝中，酒精燈加熱煅燒并翻炒至微黃，立即加入米醋20 mL醋淬，將所有物料轉移至圓底燒瓶中，加超純水40 mL，同法制備，備用。

2.2 生物發(fā)酵提取法

2.2.1 MRS 培養(yǎng)基［9］酪蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、無水葡萄糖20.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、無水磷酸氫二鉀2.0 g、七水硫酸鎂0.25 g、一水合物硫酸錳0.58 g、吐溫80 1 mL，以超純水定容到1 000 mL，pH 6.2～6.4，121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

2.2.2 菌種活化［10］取保加利亞乳桿菌的甘油凍干管，接入新配滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，80 r/min條件下?lián)u床震蕩活化培養(yǎng)24 h。后再以10%接菌量轉接至新配滅菌的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，80 r/min 條件下?lián)u床震蕩活化培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵所需的保加利亞乳桿菌的液體菌種。

2.2.3 生物發(fā)酵［11］取牡蠣、瓦楞子、蟹殼、鱉甲各5 g，各加入發(fā)酵所用的保加利亞乳桿菌菌種液15 mL，在40 ℃，80 r/min 條件下?lián)u床震蕩活化培養(yǎng)96 h。

2.2.4 生物發(fā)酵供試品溶液制備 將含有5 g 藥材的發(fā)酵液，離心過濾除去殘渣，濾液用超純水定容至100 mL，備用。

2.2.5 生物發(fā)酵空白對照品溶液制備 將15 mL 發(fā)酵96 h的發(fā)酵液，離心過濾除去殘渣，濾液定容至100 mL，備用。

2.3 條件 射頻功率1 150 W；霧化器氣體流量0.70 L/min；冷卻氣體積流量12 L/min；輔助氣體積流量0.5 L/min；分析泵速50 r/min，沖洗泵速100 r/min；積分時間長波長5 s，短波長15 s；樣品測定次數(shù)3 次；樣品沖洗時間30 s；等離子觀測方式為垂直觀測。

2.4 線性關系考察 取各元素的對照品液適量，加10%硝酸水溶液稀釋，制備一系列的混合對照品溶液，各元素的質量濃度分別為0、1、2、5、10、50 μg/mL。分別吸取各混合對照品溶液，依法測定不同體積分數(shù)的米醋配制的空白溶液及生物發(fā)酵空白溶液和系列對照品溶液，以吸光度為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），進行回歸，得各元素對照品曲線方程及線性相關系數(shù)。平行測定空白樣品溶液20 次，依照IUPAC 的方法計算檢測下限，得各待測元素的檢出限，結果見表1。表明各元素在各自范圍內線性關系良好。

表1 各元素線性關系

3 結果與分析

分別按“2.1”“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下進行測定，扣除空白溶液及生物發(fā)酵空白溶液所得結果后，得各樣品在各制備方法下元素的量。結果顯示20%米醋對樣品進行提取后，各元素提取總效率最高，故主要對純水、20%米醋、生物發(fā)酵法及傳統(tǒng)的醋淬后水提法作為體外預消化方式提取后的結果進行分析。結果見圖1、表2。

圖1 各元素含有量測定結果分析圖

當用不同體積分數(shù)米醋對樣品中Fe、Mn、Sr 及Zn 進行提取時，所得結果為隨著米醋體積分數(shù)升高，各樣品中4 種元素含有量均有不同程度的升高，且有趨于穩(wěn)定的趨勢，見圖2。除鱉甲樣品外，其余樣品中Fe 含有量均會在某一米醋體積分數(shù)時達到峰值。生物發(fā)酵法提取后4 種介殼類藥物中Mn 含有量最高，Zn 含有量最低，米醋對各樣品中Sr 的提取效率提高最顯著，且各樣品中各元素的提取效率為生物發(fā)酵法優(yōu)于20%米醋提優(yōu)于水提。另醋淬法炮制各樣品后，4 種元素的提取效率亦無生物發(fā)酵法提取效率高。

4 討論

圖2 不同體積分數(shù)米醋提取各樣品中各元素結果分析圖

本實驗采用ICP-OES 法測定介殼類藥物牡蠣、瓦楞子、蟹殼及鱉甲樣品經不同體外預消化方式提取后的微量元素Fe、Mn、Sr 及Zn 的含有量。實驗分析的元素包括Ba、Ca、Co、Cu、K、Li、Mg、Na、Ni、Se 等，但是因某些元素已有文獻表明研究較多或未在樣品中檢出或低于檢出限，且已有研究表明Fe、Mn、Sr、Zn 與治療甲狀腺疾病療效相關性較強［12-15］，故篩選了4 種元素進行測定。

表2 各元素含有量測定結果

4 種樣品經不同體外預消化方式提取后的各元素含有量差異較大，而傳統(tǒng)的醋淬法炮制4 種樣品并沒有增加4種微量元素的提取率。生物發(fā)酵法可提高4 種樣品中4 種微量元素的提取效率，其中Sr 在4 種介殼類藥物中提取的含有量均較高。另4 種樣品中提取Fe 的效率也對生物發(fā)酵法具有較強的依賴性，且3 種樣品在不同體積分數(shù)米醋提取時可達到峰值，推測米醋會與樣品發(fā)生反應從而有助于對Fe 的提取，但當米醋達到一定比例時又與鐵離子發(fā)生絡合而形成沉淀，導致提取液中Fe 含有量降低。

綜上所述，介殼類藥物中含有豐富的人體必需的微量元素，其可能在藥物藥效發(fā)揮的過程中存在一定的協(xié)同作用［16］?！吨袊幍洹?中僅以碳酸鈣的含有量作為介殼類藥物的質量評價指標，較難反映出各藥材樣品間的區(qū)別，且難以對該類藥物的效應物質基礎進行深入的研究。故本研究通過對不同體外預消化方式提取4 種介殼類藥物中的Fe、Mn、Sr 及Zn 含有量分析及比較可知，各種方式提取的介殼類藥物中的微量元素含有量差異較大，且生物發(fā)酵的體外預消化方式對提高各元素的提取效率具有一定的促進作用，其效果比20%米醋提取效果更佳。體外預消化可通過改變中藥提取液的種類及提取方式，增加各樣品中某些微量元素的提取效率。另外，生物發(fā)酵還可分解中藥湯劑中的多糖、苷類及某些多肽類物質，分解成的小分子物質更易被機體吸收及利用，如單糖、氨基酸等，從而有效地提高藥物療效［17］，以期為中草藥配制工藝的探討、傳統(tǒng)藥理的闡明、活性物質的揭示等提供參考，為微量元素與生理機能在分子水平上的研究奠定基礎。