汪英俊嚴(yán) 輝?黃勝良汪國強(qiáng)楊美權(quán)彭國平

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210013；2.江蘇融昱藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安 223001；3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；4.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223）

當(dāng)歸藥材來源于傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效［1］，是中醫(yī)臨床常用的補(bǔ)血藥和婦科要藥，素有“十方九歸”之稱，主產(chǎn)于甘肅、青海、云南、四川等省，以甘肅岷縣所產(chǎn)為道地，稱“岷當(dāng)歸”。當(dāng)歸中主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸及其主要化學(xué)成分具有廣泛的生物活性，對造血、循環(huán)、神經(jīng)系統(tǒng)等均有藥理作用［2-3］。近年來，我國中藥工業(yè)增長迅速，對中藥資源可持續(xù)供應(yīng)產(chǎn)生了巨大的壓力。2017 年，當(dāng)歸為我國中藥材十大出口品種之一，出口量在2 723.98 噸，出口額2 539.53 萬美元，出口金額占比為2.23%［4］。目前中藥材人工栽培是解決供需矛盾的主要手段，而基于化學(xué)農(nóng)業(yè)的中藥種植模式正使中藥材安全和質(zhì)量面臨前所未有的挑戰(zhàn)，與此同時(shí)，中藥材種植區(qū)域的不斷擴(kuò)大和盲目引種，也造成中藥材質(zhì)量問題日益突出［5］。

由于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，導(dǎo)致中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較為復(fù)雜［6］。當(dāng)前中藥質(zhì)量控制的方法有色譜法、一測多評法、近紅外光譜技術(shù)、多元統(tǒng)計(jì)分析法、DNA 條形碼分子鑒定法等，部分技術(shù)方法還處于發(fā)展階段，尚未大規(guī)模推廣應(yīng)用，而HPLC 法在中藥質(zhì)量控制中已被廣泛使用，具有操作簡單、快速、高效、高靈敏度的特點(diǎn)［7］。其基于整體性和模糊性特點(diǎn)的中藥指紋圖譜技術(shù)是符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式之一，化學(xué)計(jì)量學(xué)的引入進(jìn)而將中藥復(fù)雜的多成分鑒別轉(zhuǎn)化為對數(shù)據(jù)的解析，達(dá)到定性與定量研究的目的［8］。有關(guān)指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的當(dāng)歸質(zhì)量研究已有報(bào)道［9-10］，本研究在建立當(dāng)歸HPLC 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，通過對照品比對、相似度評價(jià)、主成分分析和聚類分析等識(shí)別技術(shù)對樣品進(jìn)行研究，同時(shí)對其近緣種加以區(qū)分，以期為當(dāng)歸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 Alliance 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司，含四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA 檢測器，Empower 3 工作站）；賽多利斯BSA323SCW 型電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；EPED 超純水系統(tǒng)（南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司）；KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；D2012 高速臺(tái)式離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司）；1000 型睿核高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑 對照品綠原酸（批號lw18022809）、阿魏酸（批號lw18042309）、Z-藁本內(nèi)酯（批號lw18010501）、正丁基苯酞（批號lw18012301）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號lw18041806）、洋川芎內(nèi)酯H（批號lw18042506）、阿魏酸松柏酯（批號 lw180315016）、丁烯基苯酞（批 號lw18014801）、洋川芎內(nèi)酯A（批號lw17111714）均購自南京良緯生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；超純水（Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備）；無水甲酸（上海麥克林生化試劑有限公司）；冰醋酸等試劑為分析純。

1.3 樣品 當(dāng)歸藥材來源全國不同產(chǎn)區(qū)，信息見表1。當(dāng)歸近緣種藥材信息見表2，朝鮮當(dāng)歸樣品由長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授贈(zèng)與，遼藁本樣品由遼寧省農(nóng)科院經(jīng)作所孫文松研究員贈(zèng)與，上述樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館。

表1 當(dāng)歸樣品信息

表2 當(dāng)歸近緣種樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetryshield C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5%的醋酸水（B），梯度洗脫（0～25 min，5%～45% A；25～35 min，45%～55% A；35～45 min，55% A；45～55 min，55%～95% A；55～60 min，95% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 稱取適量綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞對照品，精密稱定，加乙腈制成質(zhì)量濃度分別為0.15、0.23、0.19、0.12、0.32、0.73、0.28、1.25、0.45 mg/mL 的對照品貯備液。分別精密吸取貯備液1 mL 置于10 mL 量瓶中，加乙腈稀釋定容，搖勻。

2.3 供試品溶液制備 取當(dāng)歸藥材粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入3%甲酸甲醇25 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（編號S1）10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以Z-藁本內(nèi)酯為參照峰，得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.08%～0.45%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.06%～0.73%。表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一當(dāng)歸樣品5 份（編號S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以Z-藁本內(nèi)酯為參照峰，得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.07%～0.15%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.05%～1.79%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（編號S1），在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以Z-藁本內(nèi)酯為參照峰，得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.05%～0.15%，各共有峰相對峰面積RSD 為0.35%～1.25%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 指紋圖譜建立 精密稱定35 批不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品，每份約0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得色譜圖。將其導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）進(jìn)行分析，以樣品S1 的色譜圖為參照，以中位數(shù)法生成對照圖譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后生成指紋圖譜的共有模式見圖1。

圖1 35 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.5.2 共有模式建立及色譜峰定位 根據(jù)35 批當(dāng)歸樣品指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，生成對照圖譜。在對照圖譜上標(biāo)定24 個(gè)共有峰。通過與對照品色譜圖中保留時(shí)間比對，指認(rèn)8 個(gè)共有峰，其中3 號峰為綠原酸、6 號峰為阿魏酸峰、7 號峰為洋川芎內(nèi)酯Ⅰ峰、8 號峰為洋川芎內(nèi)酯H峰、13 號峰為阿魏酸松柏酯峰、14 號峰為正丁基苯酞峰、17 號峰為Z-藁本內(nèi)酯峰、18 號峰丁烯基苯酞峰，其中以峰面積大且分離度較好的17 號峰為參照峰（S），得各共有峰相對保留時(shí)間RSD 為0.20%～0.64%，相對峰面積RSD為23.3%～64.5%，表明不同產(chǎn)地不同批次樣品含有量存在差異，見圖2。

2.5.3 相似度評價(jià) 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版），對35 批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算得35 批樣品和對照指紋圖譜之間的相似度，結(jié)果見表3，35 批樣品相似度為0.824～0.989，表明當(dāng)歸的化學(xué)成分組成較為相似，各批次當(dāng)歸中化學(xué)成分含有量存在一定差異，S23 和S24 號樣品相似度較低，可能與藥材產(chǎn)地、生長年限、栽培及采收加工貯藏等因素有關(guān)，需進(jìn)一步分析。

2.5.4 近緣種指紋圖譜 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，得11批當(dāng)歸近緣屬藥材樣品HPLC 圖譜，將當(dāng)歸藥材樣品HPLC對照指紋圖譜和11 批近緣屬藥材樣品HPLC 圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版），結(jié)果見圖3。得到7 批近緣屬藥材樣品相似度，其中白芷（0.160）、朝鮮當(dāng)歸（0.253）、川芎（0.772）、獨(dú)活（0.203）、遼藁本（0.759）、歐當(dāng)歸（0.706）、野生當(dāng)歸（0.852）、防風(fēng)（0.046）、前胡（0.039）、日本當(dāng)歸（0.115）。

圖2 各成分HPLC 色譜圖

表3 35 批樣品相似度

當(dāng)歸在我國使用歷史悠久，易混品、偽品較多，來源復(fù)雜，分布廣泛，有些系同屬植物，藥性相近；有些系其他科屬植物，藥性全然不同，混用摻偽給用藥安全帶來極大隱患。根據(jù)相似度并結(jié)合色譜圖發(fā)現(xiàn)白芷、朝鮮當(dāng)歸、獨(dú)活、防風(fēng)、前胡與當(dāng)歸整體峰形差別較大，采用HPLC指紋圖譜可以從化學(xué)成分上較好地進(jìn)行區(qū)別；而歐當(dāng)歸、川芎、藁本與當(dāng)歸的指紋圖譜相似度較高，共有峰較多，表明他們之間的化學(xué)成分相似，結(jié)果見圖4。但川芎在35～36 min 時(shí)出現(xiàn)一較高峰，經(jīng)對照指認(rèn)為洋川芎內(nèi)酯A，為川芎藥材特征峰，而當(dāng)歸中幾乎不含有洋川芎內(nèi)酯A，可作為二者的特征性鑒別成分。從圖譜對比中可以看出，川芎和藁本中均存在特征峰，可與當(dāng)歸進(jìn)行區(qū)別；歐當(dāng)歸的化學(xué)成分與我國當(dāng)歸相近，兩者有較高的相似度，但二者在Z-藁本內(nèi)酯含有量差異明顯，研究表明歐當(dāng)歸藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為中國當(dāng)歸的25.23%，并指出中、日、韓，歐洲當(dāng)歸原植物的來源不同，藁本內(nèi)酯等活性成分有顯著差異，其功效也會(huì)不同［11］，因此不宜替代、混淆用藥。

圖3 11 批當(dāng)歸近緣種藥材HPLC 指紋圖譜

圖4 當(dāng)歸、川芎、藁本及歐當(dāng)歸圖譜比較

2.6 聚類分析 將35 批樣品的24 個(gè)共有峰的峰面積作為變量，導(dǎo)入到SPSS 22.0 軟件，得到35×24 階原始數(shù)據(jù)矩陣，采用組間聯(lián)結(jié)，利用平均歐式距離法作為樣品間距離計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖4。聚類結(jié)果表明在聚類閾值底層，藥材產(chǎn)地較近，隨著閾值增加，產(chǎn)地相同或地理距離較近的樣品被聚在一起，35 批樣品可分為三大類，其中S23 和S24 單獨(dú)聚為一類；來自云南（S11～S15）的聚為一類；甘肅與青海的聚為一類，其中來自岷縣西寨鎮(zhèn)當(dāng)歸標(biāo)準(zhǔn)化原料基地的藥材（S1～S10）也基本聚在一起，表明不同產(chǎn)地的當(dāng)歸藥材在質(zhì)量上存在一定差異，當(dāng)歸藥材具有明顯的地域區(qū)分性。聚類結(jié)果與相似度分析結(jié)果一致，可用于當(dāng)歸藥材質(zhì)量一致性評價(jià)，見圖5。

2.7 主成分及因子分析 運(yùn)用SPSS 22.0 及Simca 13.0 軟件對35 批樣品24 個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，計(jì)算主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率，結(jié)果抽樣適合性檢驗(yàn)系數(shù)KMO 值=0.821 ＞0.7，且巴特利特球形檢驗(yàn)顯著性P=0＜0.05，因此數(shù)據(jù)適合做因子分析。見表4。

主成分的特征值及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)。以特征值大于1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，表1 可知前5 種主成分的方差累積貢獻(xiàn)率為85.786%，表明提取的5 種主成分可以代表原始色譜峰峰面積的大部分信息，能較好的反映當(dāng)歸藥材指紋圖譜特征。

圖5 35 批樣品聚類樹狀圖

表4 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率

表5 旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣

旋轉(zhuǎn)后共有峰因子負(fù)荷矩陣，見表5。結(jié)果表明，第一主成分包含的各因子其載荷系數(shù)綜合體現(xiàn)峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰12 和峰18 對第一主成分的影響；峰6、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰19、峰20、峰23 在第二主成分中有明顯正負(fù)荷值；第三主成分反映了峰21 和峰24 的信息；第四主成分反映峰4 和峰11 的信息；第五主成分反映了峰3 的信息?？梢?、第一主成分和第二主成分集中反映了當(dāng)歸藥材中藥效指標(biāo)成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎內(nèi)酯1）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本內(nèi)酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析變量上權(quán)重值較大，其中峰6 為阿魏酸峰，為當(dāng)歸藥材的法定指標(biāo)性成分。以PC1 和PC2 建立坐標(biāo)系進(jìn)行投影，得35 批樣品主成分得分矩陣圖，見圖6，可直觀顯示樣品間的差異。表明，S11～S15 投影聚在一起，S23、S24 號當(dāng)歸藥材與其他產(chǎn)地藥材投影點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。

圖6 35 批樣品主成分得分矩陣圖

35 批樣品的性狀及特征圖譜進(jìn)行綜合評價(jià)，發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分較為一致，但各成分的含有量存在差異。由相似度及聚類分析結(jié)果可知，云南的樣品聚為一大類，青海的樣品與甘肅的樣品聚為一大類，分析云南樣品的指紋圖譜共有峰峰面積時(shí)，發(fā)現(xiàn)6 號、13 號與17 號峰的峰面積較其他產(chǎn)區(qū)大，表明3 種成分在云歸中含有量較高。

在主成分分析中，第一主成分和第二主成分集中反映了當(dāng)歸藥材中的藥效指標(biāo)成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎內(nèi)酯Ⅰ）、8（洋川芎內(nèi)酯H）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本內(nèi)酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析變量上權(quán)重值較大，其中峰6 為阿魏酸、峰17 為藁本內(nèi)酯，為主要指標(biāo)性成分，其中藁本內(nèi)酯在當(dāng)歸含有量較高，且具有松弛平滑肌的作用，是抗膽堿和乙酰膽堿的良藥?！断愀壑兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》 中收載了當(dāng)歸藥材中藁本內(nèi)酯的含有量測定項(xiàng)目，因此，建議當(dāng)歸藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)當(dāng)加入關(guān)于藁本內(nèi)酯含有量的規(guī)定，以便更為全面地控制當(dāng)歸質(zhì)量。同時(shí)本研究后期需要增加樣本量及產(chǎn)地的代表性，進(jìn)一步研究不同產(chǎn)區(qū)當(dāng)歸的質(zhì)量差異。

3 討論

3.1 指紋圖譜建立 對當(dāng)歸藥材的提取條件、方式及檢測波長等進(jìn)行了考察。同時(shí)對乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸水和乙腈-0.5%醋酸水等流動(dòng)相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.5%醋酸水作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)各色譜峰分離度較好。實(shí)驗(yàn)前期曾分別比較25% 甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇和3%甲酸甲醇4 種溶劑對阿魏酸、Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ等成分提取效率的影響；比較不同提取方式（回流與超聲）對色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的提取方式對13 號峰（阿魏酸松柏酯）影響明顯，加熱回流提取此峰完全消失，可見阿魏酸松柏酯遇熱不穩(wěn)定，極易分解，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，阿魏酸松柏酯受熱遇光極易分解成阿魏酸和松柏醇［12］。因此《中國藥典》 中用回流提取的方式測定阿魏酸含有量可能不真實(shí)；對提取時(shí)間的考察，分別比較超聲提取30、45、60 min 對色譜圖的影響，30 min 提取效率最佳。通過條件優(yōu)化，最終建立了分離度好、色譜峰較全面的當(dāng)歸HPLC 指紋圖譜，共確認(rèn)24 個(gè)共有峰，通過對照品比對，結(jié)合紫外吸收光譜特征，指認(rèn)出8 個(gè)共有峰。

3.2 有效成分含有量差異 云南產(chǎn)當(dāng)歸中指標(biāo)性成分阿魏酸含有量較高，阿魏酸是當(dāng)歸酚酸類代表性成分，也是當(dāng)歸的中藥活性成分之一，其鈉鹽在心腦血管疾病方面具有廣泛的效用。張金渝等［13］比較不同產(chǎn)地云當(dāng)歸中阿魏酸的含有量發(fā)現(xiàn)，大理鶴慶馬廠產(chǎn)當(dāng)歸阿魏酸含有量最高可達(dá)1.459 mg/g；孫紅梅等［14］也發(fā)現(xiàn)云南省沾益縣當(dāng)歸雖然外觀不具有優(yōu)勢，但是其指標(biāo)成分含有量較高。云當(dāng)歸多栽培于云南西北部高寒山區(qū)，主要分布于大理、麗江、迪慶等地，低緯度高海拔及優(yōu)越的氣候條件成就了云歸的品質(zhì)，產(chǎn)地環(huán)境氣候與藥材品質(zhì)的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步探討。近年來，昆明、曲靖等地當(dāng)歸栽培面積增長較快，其產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境、栽培方式、加工方法，以及藥材外觀性狀、品質(zhì)與傳統(tǒng)云歸均有一定區(qū)別，有待進(jìn)一步評價(jià)。

中藥材是中醫(yī)藥的源頭，中藥質(zhì)量的提升必須對藥材質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控。近年來由于市場需求劇增及國家政策的影響，發(fā)展中藥材栽培已成為很多地區(qū)脫貧致富及產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的選擇，不同產(chǎn)地的藥效物質(zhì)有所差異，用藥的安全性、有效性尚需深入研究。借鑒中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究的思維模式和方法，著眼于中藥生產(chǎn)全過程的物質(zhì)基礎(chǔ)特有、差異、動(dòng)態(tài)變化和質(zhì)量的傳遞性、溯源性，有利于建立中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源體系，以期為質(zhì)控提供新的思路和方法［15］，有助于中藥質(zhì)量控制體系的逐步完善。