喬 燕，朱瀟瀟，吳建元，吳 娟，張興德

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023）

咳嗽是比較常見的臨床癥狀，多由呼吸系統(tǒng)疾病引起，是學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童比較常見的疾病?？人缘闹饕l(fā)病機(jī)制與細(xì)胞免疫失衡、氣道慢性炎癥的形成有關(guān)［1］。目前，臨床上針對(duì)咳嗽只能對(duì)癥處理，小劑量激素、抗生素、鎮(zhèn)咳藥是比較常用的藥物［2］。但以上藥物的維持時(shí)間較為短暫，容易造成病情反復(fù)，而且西藥的不良反應(yīng)也時(shí)有報(bào)道。中醫(yī)藥注重標(biāo)本兼治，在治療咳嗽方面積累了大量的經(jīng)驗(yàn)。清宣止咳顆粒是小兒外感風(fēng)寒咳嗽的一種常用藥，處方來源于我國(guó)第一批國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)張珍玉教授多年臨床行之有效的經(jīng)驗(yàn)方，已經(jīng)被大量文獻(xiàn)報(bào)道在改善咳嗽臨床癥狀方面有較好的療效［3-4］。但目前有關(guān)清宣止咳顆粒藥物作用機(jī)制的研究較少。選取清潔級(jí)Wistar 大鼠為研究對(duì)象，通過清宣止咳顆粒來干預(yù)咳嗽模型大鼠，探討清宣止咳顆粒的抗炎和免疫作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 50 只清潔級(jí)Wistar 大鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018-0007），健康雄性，體質(zhì)量180～220 g，于研究院動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，清潔Ⅱ級(jí)，室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度50%。

1.2 試劑與藥物 清宣止咳顆粒（江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z1999066，10 g/袋，5 袋/盒），由桑葉、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陳皮、枳殼、紫菀、甘草九味中藥組成。10% 水合氯醛（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)47335-U MSDS）；LPS（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)L2630 MSDS）；辣椒素（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)M1022 MSDS）；10%中性福爾馬林（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)47083-U MSDS）；IL-4 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E04 635 r）；IL-8 試劑盒（美國(guó)Kamiya Biomedical 公司，貨號(hào)KT-60204）；TNF-α 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E11987r）；IgE 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E07984r）；LTC-4 試劑盒（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號(hào)YM-2978B）；IFN-γ 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)CSB-E04579r）。

2 方法

2.1 造模 將所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、清宣止咳顆粒低、中、高劑量組。清宣止咳顆粒組建立咳嗽模型，參照相關(guān)文獻(xiàn)中的造模方案［5］。將大鼠放入1 m3的染毒箱內(nèi)進(jìn)行香煙煙霧暴露，以鋸屑末50 g 加10 只香煙點(diǎn)燃煙熏，1 次/d，熏煙40 min/次，連續(xù)12 d。大鼠在此期間自由飲水進(jìn)食。每日觀察記錄大鼠的一般狀況，包括體質(zhì)量、呼吸、進(jìn)食水量、肛溫、精神狀況、毛發(fā)等。第13、16、19 天采用10%水合氯醛麻醉后，將0.4 mg/mL 的LPS 溶液滴入大鼠的鼻腔，滴入量以10 μL/g 計(jì)算。第14、15、17、18、20 天將大鼠置于透明密閉容器中霧化吸入的辣椒素溶液（1×10-4mol/L）3 min進(jìn)行激發(fā)，觀察2 min，1 次/d。觀察各組大鼠的狀態(tài)。當(dāng)大鼠出現(xiàn)呼吸加深、加快、急促、咳嗽，鼻部濕潤(rùn)，行動(dòng)呆滯或俯伏不動(dòng)等表現(xiàn)時(shí)提示造模成功。于造模第19 d 開始灌胃干預(yù)。

2.2 分組、給藥 造模成功后清宣止咳顆粒組采用清宣止咳顆粒藥物灌胃，清宣止咳顆粒低、中、高劑量組給藥劑量分別為清宣止咳顆粒0.75、1.5、3.0 g/kg 以原藥計(jì)算［6］，灌藥體積為10 mL/kg；模型組給予同等體積的生理鹽水灌胃，灌胃1 次/d，連續(xù)給藥15 d。

2.3 HE 染色 將所取得的大鼠的鼻竇組織經(jīng)10%中性福爾馬林浸泡后采用石蠟包埋，制作切片，厚度為4 μm?？靖珊髮?duì)相應(yīng)的切片編號(hào)，光學(xué)顯微鏡下觀察大體組織病變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.4 血液指標(biāo)的檢測(cè) 取大鼠的腹主動(dòng)脈血，離心機(jī)離心分離血清后進(jìn)行指標(biāo)的檢測(cè)。炎性因子指標(biāo)包括白IL-4、IL-8、TNF-α，免疫調(diào)節(jié)因子指標(biāo)包括IgE、LTC-4、IFN-γ，以上指標(biāo)均采用ELISA 法測(cè)定。嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。以上實(shí)驗(yàn)過程的指標(biāo)檢測(cè)均由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件，計(jì)量資料采用（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析，以P≤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀態(tài) 造模前各組大鼠的體質(zhì)量均衡，進(jìn)食飲水、呼吸、肛溫等基本一致，無顯著性差異?？瞻捉M大鼠毛發(fā)有光澤、呼吸平穩(wěn)、行動(dòng)靈活、糞便正常。模型組和清宣止咳顆粒組的大鼠造模后毛發(fā)不榮，眼睛無神，煩躁不安、呼吸急促、咳嗽喘息、消瘦、活動(dòng)減少。模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，清宣止咳顆粒組隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，咳嗽、咳喘癥狀逐漸減輕，飲食、飲水、行為活動(dòng)趨于正常。實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠死亡2 只，清宣止咳顆粒低劑量組死亡1 只大鼠。

3.2 大鼠鼻竇黏膜組織HE 染色 空白組大鼠鼻竇黏膜上皮完整，管腔未擴(kuò)大，無明顯增生和壞死，黏膜下層未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組的鼻竇黏膜上皮細(xì)胞變性嚴(yán)重（滲出、水腫、出血），黏膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖毛變性壞死脫落。清宣止咳顆粒組的大鼠鼻竇黏膜上皮細(xì)胞增生，部分纖毛變性，黏膜下層可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組大鼠鼻竇黏膜組織HE 染色（×40）

3.3 大鼠的炎癥因子水平 與空白組比較，模型組IL-4、IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，清宣止咳顆粒高劑量組IL-4、IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 清宣止咳顆粒對(duì)大鼠的炎癥因子的影響（）

表1 清宣止咳顆粒對(duì)大鼠的炎癥因子的影響（）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.4 大鼠免疫調(diào)節(jié)水平 與空白組比較，模型組IgE、LTC-4 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，清宣止咳顆粒高劑量組IgE、LTC-4 水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 清宣止咳顆粒對(duì)大鼠的免疫調(diào)節(jié)指標(biāo)的影響（）

表2 清宣止咳顆粒對(duì)大鼠的免疫調(diào)節(jié)指標(biāo)的影響（）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，# P＜0.05。

4 討論

咳嗽常急性起病，反復(fù)發(fā)作，治療起來具有一定的難度。目前多數(shù)學(xué)者都認(rèn)為咳嗽與多種炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子共同參與的氣道高反應(yīng)性有關(guān)［7］。臨床上對(duì)咳嗽多以對(duì)癥治療為主，臨床應(yīng)避免繼發(fā)細(xì)菌感染。但西藥治療具有反復(fù)發(fā)作及突發(fā)性表現(xiàn)，應(yīng)用中成藥最佳。中成藥制劑具有多靶點(diǎn)，能夠調(diào)理患兒的機(jī)體、提高全面免疫力，減少反復(fù)發(fā)作。清宣止咳顆粒是一種純中藥制劑，由桑葉、杏仁、薄荷、桔梗、白芍、陳皮、枳殼、紫菀、甘草九味中藥組成，獨(dú)具用藥風(fēng)格，藥均溫潤(rùn)、不寒不熱，藥性溫和，以輕宣為主，不傷稚陰及脾胃。該中成藥可宣肺止咳、祛風(fēng)解痙，對(duì)小兒常見的咳嗽咳痰、鼻塞流涕、咽痛咽癢以及發(fā)熱等都有較好的療效。清宣止咳顆粒具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎的藥理作用［3］，能夠養(yǎng)血護(hù)肺，在不引起2 次損傷的情況下，修復(fù)現(xiàn)有損傷。

本研究通過清宣止咳顆粒干預(yù)咳嗽大鼠模型，探討作用機(jī)制。結(jié)果顯示，清宣止咳顆粒能夠顯著減輕咳嗽大鼠的鼻竇黏膜上皮的病理表現(xiàn)，鼻竇黏膜上皮細(xì)胞無明顯的壞死，伴少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，清宣止咳顆粒高劑量組大鼠的IL-4、IL-8 及TNF-α 均顯著低于模型組（P＜0.05）。IL-4、IL-8 及TNF-α 屬于比較常見的炎性因子，在氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。其中IL-4 可影響T 細(xì)胞分化，啟動(dòng)和維持炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IgE 的合成與分泌，嗜酸細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活［8］。IL-8 可趨化和激活中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)，加重氣道炎癥，導(dǎo)致氣道平滑肌肥大增，引起氣道黏膜水腫。TNF-α 是巨噬細(xì)胞分泌的肽類炎性介質(zhì)，可刺激蛋白溶解酶、氧自由基的大量釋放，誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使中性粒細(xì)胞黏附和聚集，改變氣道產(chǎn)生炎性，增高氣道反應(yīng)性［9］。模型組的IL-4、IL-8 及TNFα 較空白組顯著上升，表明以上因子與氣道炎癥的形成關(guān)系及氣道高反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，清宣止咳顆粒高劑量組的IgE、LTC-4 低于模型組，IFN-γ 高于模型組（P＜0.05）。IgE 是一種免疫球蛋白，可參與肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的免疫功能，屬于過敏反應(yīng)的介導(dǎo)物質(zhì)。LTC-4是體內(nèi)白三烯的主要組成部分，參與氣道高炎癥反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)大量聚集［10］。IFN-γ 是一種保護(hù)性免疫調(diào)節(jié)因子，能夠增加宿主的防御能力［11］。模型組IgE、LTC-4 顯著升高，IFN-γ 顯著降低，而清宣止咳顆粒則改善了這種狀態(tài)，這說明清宣止咳顆粒可通過調(diào)節(jié)三者的血清含有量，達(dá)到調(diào)節(jié)集體免疫功能紊亂，抑制或阻斷氣道慢性炎癥反應(yīng)的目的。這可能是清宣止咳顆粒治療咳嗽的重要作用機(jī)制。

綜上所述，清宣止咳顆粒能夠抑制咳嗽大鼠炎癥細(xì)胞細(xì)胞因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫異常，這可能是其治療咳嗽的作用機(jī)制。