郭 瑩，張則一，周展羽

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉，主產(chǎn)于我國(guó)，用于瘀血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱等證。已制成銀杏葉提取物（Ginkgo bilobaextract，EGB）［1］，并以銀杏葉片、注射劑等多種制劑形式用于臨床，在治療心腦血管疾病等方面發(fā)揮了很好的療效。銀杏葉提取物主要由黃酮和萜內(nèi)酯類化合物組成［2-4］，黃酮和萜內(nèi)酯均對(duì)心腦血管疾病有一定的保護(hù)作用，兩者在EGB 中是否協(xié)同起效是探究的關(guān)鍵問(wèn)題。

前期體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究表明，銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯具有一定的協(xié)同作用，兩者配比為4∶1 時(shí)作用最強(qiáng)，和銀杏葉片及藥典對(duì)銀杏葉提取物所規(guī)定的比例相吻合［1］，也和文獻(xiàn)報(bào)道相一致［5］。本研究是在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯及聯(lián)合應(yīng)用（相當(dāng)于銀杏葉片或銀杏葉提取物）對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，闡明銀杏葉提取物多組分（黃酮和內(nèi)酯）配伍的合理性。

1 材料和儀器

1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。

1.2 試劑與藥物 銀杏黃酮（南京世州生物科技有限公司，批號(hào)20160315YXHT，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85%）；銀杏內(nèi)脂（南京世州生物科技有限公司，批號(hào)20160308YXNZ，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）；尼莫地平片（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)1511013）；水合氯醛（分析純，阿拉丁試劑有限公司，批號(hào) 20160215）；超氧化 物歧化 酶（SOD，批 號(hào)20160628）、丙二醛（MDA，批號(hào)20160629）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β，批號(hào)20160625）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，批號(hào)20160628）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)20160627）、蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20160625）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TTC 染色試劑盒（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)BCBR5462）；雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器 BS323S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；318C+酶標(biāo)儀（上海沛歐分析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 構(gòu)建動(dòng)物MCAO 模型 采用線栓法造模，首先用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，術(shù)區(qū)常規(guī)剃毛消毒，將頸部正中右旁側(cè)切開(kāi)，逐層分離，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，掛線備用。隨后于頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈掛線，分離露出頸外動(dòng)脈主干，在其根部打結(jié)。用動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端。在頸總動(dòng)脈近頭端距分叉部5 mm 左右斜剪一小口，導(dǎo)入線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈。移除頸內(nèi)動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，將線栓插至所需深度，遇阻力即停。結(jié)扎切口處頸總動(dòng)脈掛線，移開(kāi)頸總動(dòng)脈上的血管夾。確認(rèn)無(wú)出血后計(jì)時(shí)，缺血1 h 后拔除線栓形成再灌注［6-7］。

2.2 分組與給藥 將SD 大鼠隨機(jī)分為銀杏內(nèi)酯組、銀杏黃酮組、聯(lián)合給藥組、尼莫地平組、模型組、假手術(shù)組，每組8 只。再灌注同時(shí)，灌胃給予銀杏黃酮組銀杏黃酮6 mg/kg，銀杏內(nèi)酯組給予銀杏內(nèi)酯6 mg/kg，聯(lián)合用藥組給予銀杏黃酮4.8 mg/kg 及銀杏內(nèi)酯1.2 mg/kg，尼莫地平組給予尼莫地平6.25 mg/kg，模型組與假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，飼養(yǎng)期間內(nèi)各組大鼠自由飲水進(jìn)食。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 采用longa 評(píng)分［8］法進(jìn)行評(píng)分，1～4分為造模成功。0 分，無(wú)任何神經(jīng)功能缺損的癥狀，活動(dòng)正常；1 分，輕微神經(jīng)功能缺損，對(duì)側(cè)前肢保持屈曲狀態(tài)；2 分，中度神經(jīng)功能缺損，向?qū)?cè)爬行轉(zhuǎn)圈；3 分，重度神經(jīng)功能缺損，向偏癱側(cè)身體傾倒；4 分，無(wú)法自主行走，意識(shí)喪失；5 分，死亡。

2.4 TTC 染色測(cè)定腦梗死比 將大鼠斷頭取腦，用生理鹽水漂洗，隨后置于冰箱冷凍層冷凍20 min，去除嗅腦、小腦和腦干，作冠狀切片，共6 片。37 ℃條件下0.5% TTC溶液孵育10 min，用濾紙吸干表面，拍照，采用Image pro plus 軟件分別計(jì)算出全腦面積和梗死面積，計(jì)算腦梗死面積百分比［8］。腦梗死面積百分比=（梗死面積/全腦面積）×100%。

2.5 腦組織中腦缺血相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 取右腦稱定質(zhì)量后置于冰水浴的研缽內(nèi)，加入4 ℃生理鹽水100 μL 碾磨，碾磨過(guò)程中持續(xù)加入低溫生理鹽水，加入總量為腦組織質(zhì)量的9 倍量。3 000 r/min 離心15 min，取上清得10% 腦勻漿，上清稀釋10 倍后，可得1%腦勻漿。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD 水平。

3 結(jié)果

3.1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠一周體質(zhì)量變化 各實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)7 d的體質(zhì)量變化見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠體質(zhì)量下降，且體質(zhì)量恢復(fù)緩慢，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，各給藥組均有體質(zhì)量先減輕后升高的趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠一周體質(zhì)量變化

3.2 神經(jīng)功能評(píng)分 根據(jù)longa 評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分，見(jiàn)表1。假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)無(wú)異常癥狀；與模型組比較，隨著時(shí)間推移，各給藥組評(píng)分有下降趨勢(shì)，表明神經(jīng)功能得到逐步恢復(fù)。除尼莫地平組外，其他3 組雖有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，可能和神經(jīng)功能變化相對(duì)于其他指標(biāo)變化略為滯后有關(guān)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠一周神經(jīng)功能評(píng)分一覽表（，n＝6）

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠一周神經(jīng)功能評(píng)分一覽表（，n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

3.3 TTC 染色測(cè)定腦梗死面積百分比 按“2.4”項(xiàng)下方法制作大鼠腦冠狀切片，選取第3 片測(cè)量腦梗死比，結(jié)果見(jiàn)圖2、表2。假手術(shù)組無(wú)梗死，模型組腦梗死面積百分比增加（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組腦梗死百分比降低（P＜0.01），其中尼莫地平組腦梗死百分比最小，聯(lián)合給藥組優(yōu)于銀杏黃酮組（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦冠狀切片對(duì)比

表2 各組大鼠大腦切片腦梗死比結(jié)果（，n＝6）

表2 各組大鼠大腦切片腦梗死比結(jié)果（，n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與銀杏黃酮組比較，△P＜0.05。

3.4 腦組織中腦缺血相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3.4.1 各組大鼠腦組織中TNF-α 水平 由圖3 可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中TNF-α 水平增加（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯組TNF-α 水平減少（P＜0.05），銀杏黃酮組、聯(lián)合用藥組和尼莫地平組TNF-α 水平減少（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腦組織中TNF-α 水平（n＝6）

3.4.2 大鼠腦組織中MDA 水平 由圖4 可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中MDA 水平增加（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠腦組織中MDA 水平降低（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組優(yōu)于銀杏內(nèi)酯組和銀杏黃酮組（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠腦組織中MDA 水平（n＝6）

3.4.3 大鼠腦組織中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平 由圖5 可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中IL-1β 和IL-6 水平增加（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠腦組織中IL-1β 和IL-6 水平降低（P＜0.01），聯(lián)合用藥組IL-1β 水平的降低明顯優(yōu)于銀杏黃酮組（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠腦組織中IL 水平（n＝6）

3.4.4 大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）水平 大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織CuZn-SOD、T-SOD 水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，銀杏內(nèi)酯組和銀杏黃酮組大鼠腦組織T-SOD 水平升高（P＜0.05），聯(lián)合用藥組和尼莫地平組大鼠腦組織CuZn-SOD、T-SOD 水平升高（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組在升高大鼠腦組織CuZn-SOD 水平優(yōu)于銀杏內(nèi)酯組（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠腦組織中CuZn-SOD 和T-SOD 水平（n＝6）

4 討論

腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)通過(guò)多途徑激發(fā)產(chǎn)生的大量自由基成為加重腦損傷的重要因素，并可通過(guò)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)使損傷進(jìn)一步加重。SOD 為機(jī)體十分重要的自由基清除劑，過(guò)多的氧自由基將消耗大量的SOD，降低其活性［9］。大量的活性氧（ROS）能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，從而損傷組織DNA［10-12］。銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯以及聯(lián)合用藥均可顯著降低大鼠腦組織中MDA 水平，聯(lián)合用藥顯著優(yōu)于單用；三者可不同程度顯著升高T-SOD 水平，聯(lián)合用藥還可顯著升高CuZn-SOD 活力，效果顯著優(yōu)于銀杏內(nèi)酯組。表明銀杏黃酮及銀杏內(nèi)酯對(duì)氧自由基有一定清除作用，減少氧自由基對(duì)腦細(xì)胞損傷，兩者聯(lián)合應(yīng)用可更好地發(fā)揮清除自由基和保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用。

TNF-α、IL-1β 和IL-6 為3 種炎癥細(xì)胞因子，其中IL-1β 在正常腦組織中低表達(dá)，而在腦缺血再灌注損傷發(fā)生后分泌增多，刺激單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 和IL-6 等細(xì)胞因子，進(jìn)一步加重局部炎癥反應(yīng)［13］，破壞血腦屏障。腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，TNF-α 表達(dá)迅速增加，并與其受體結(jié)合，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響細(xì)胞程序性死亡和非程序性死亡。在急性炎癥發(fā)生時(shí)，IL-6 能促進(jìn)急性期蛋白的合成，并促進(jìn)TNF-α 和IL-1 所誘導(dǎo)的惡病質(zhì)［14］。銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯以及聯(lián)合用藥均可不同程度顯著降低大鼠腦組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平，聯(lián)合用藥降低IL-1β 水平的效果明顯優(yōu)于銀杏黃酮單用（P＜0.01）。說(shuō)明三者均可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)修復(fù)腦缺血再灌注損傷，兩者合用對(duì)IL-1β 的抑制作用顯著優(yōu)于銀杏黃酮單用。

前期實(shí)驗(yàn)研究表明，銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯可在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮良好的協(xié)同作用，兩者質(zhì)量比為4∶1 時(shí)協(xié)同作用最佳，和文獻(xiàn)報(bào)道［5］相吻合。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型上進(jìn)一步探究?jī)烧叩膮f(xié)同作用。綜上可知，銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯可通過(guò)清除自由基、抑制炎癥反應(yīng)等改善大鼠腦缺血再灌注損傷，兩者合用可協(xié)同起效，尤其在降低MDA 水平（優(yōu)于銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯）、升高CuZn-SOD 水平（優(yōu)于銀杏內(nèi)酯）、降低IL-1β 水平（優(yōu)于銀杏黃酮）、降低腦梗死百分比（優(yōu)于銀杏黃酮）方面協(xié)同作用顯著。兩者協(xié)同起效的機(jī)制是否通過(guò)相互促進(jìn)體內(nèi)吸收和分布，或是通過(guò)多組分多靶點(diǎn)是否發(fā)揮協(xié)同作用，或是通過(guò)其他機(jī)制形成合力，這將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中做進(jìn)一步探究。