章 波檀燕君麥婉婷郭富雙梁秋云黃秋潔葉 勇?

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.南寧市第一人民醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530001）

慢性肝損傷所導(dǎo)致的肝臟纖維化是一個(gè)可逆過(guò)程，其受多種機(jī)制調(diào)節(jié)。肝纖維化產(chǎn)生的中心環(huán)節(jié)為肝星狀細(xì)胞活化，活化的肝星狀細(xì)胞大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，使得細(xì)胞外基質(zhì)生成與降解平衡紊亂，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而產(chǎn)生肝纖維化［1］。白背葉根Mallotus apelta（lour.）Muell.-Arg.root 為大戟科植物白背葉的干燥根，民間常用其治療肝炎。有研究［2-3］表明白背葉根對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化有較好的治療作用，但對(duì)其作用機(jī)制研究尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的研究，在分子水平探討其抗肝纖維化的機(jī)制，以期為白背葉根藥用價(jià)值的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物 白背葉根采于廣西壯族自治區(qū)賀州市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)傅鵬副教授鑒定為大戟科植物白背葉的根；秋水仙堿（批號(hào)20170718，）購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量170～200 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（桂）2014-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物使用 許可證 SYXK（桂）2014-0003。

1.3 試劑 PC-Ⅲ（批 號(hào)20171010）、Col-Ⅳ（批號(hào)20171102）、HA（批號(hào)20170910）、LN（批號(hào)20171010）、MMP-9（批號(hào)20171210）購(gòu)自上海源葉生物科技公司；IL-1β（批號(hào)R180102-007 a）、IL-6（批號(hào)R180102-003a）試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；TRIZOL 試劑（批號(hào)180401）、逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒（批 號(hào)00621709）購(gòu)自美 國(guó)Thermo Fisher 公司；qPCR 試劑盒（批號(hào)154047520）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公 司；NF-κBp65（批 號(hào)00057379）、IκBα（批號(hào)00024903）兔多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔-IgG（批號(hào)9300014001）購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.4 儀器 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi 公司）；紫外分光光度計(jì)（日本津島公司）；連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；MP-300 V 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 白背葉根水提取物制備 白背葉根陰干后粉碎至粗粉，稱取100 g，1 000 mL 雙蒸水煎煮2 h，紗布過(guò)濾，得提取液。藥渣以上述方法煎煮2 次，合并濾液，離心去渣。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，干燥至膏狀，以雙蒸水配成5 g/mL（生藥量）溶液，儲(chǔ)于4 ℃冰箱備用。

2.2 造模、分組、給藥 將SD 雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，模型組，秋水仙堿組（0.2 mg/kg），白背葉根水提取物高、中、低劑量組（生藥5、2.5、1.25 g/kg），每組12 只。除對(duì)照組灌胃給予橄欖油外，其余各組大鼠給予體積分?jǐn)?shù)50% CCl4的橄欖油（1 mL/kg）造模，每周灌胃給藥2 次，每5 d 根據(jù)實(shí)際體質(zhì)量調(diào)整CCl4劑量；第8 周，對(duì)照組、模型組給予等量生理鹽水，給藥組按照給藥劑量灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)給藥8 周，同時(shí)除對(duì)照組灌胃給予橄欖油外，其余各組大鼠給予體積分?jǐn)?shù)50%CCl4的橄欖油（1 mL/kg）造模。

2.3 血清及肝臟標(biāo)本的采集 大鼠處死前一晚禁食不禁水，采血前稱定各組大鼠體質(zhì)量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，無(wú)抗凝真空采血管腹主動(dòng)脈采血，常溫下3 000 r/min離心血液，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存，用以后續(xù)測(cè)定MMP-9、IL-1β、IL-6 水平。各組大鼠肝臟以生理鹽水清洗后稱定質(zhì)量，切取肝左葉邊緣2 cm 大小，置于10%福爾馬林溶液固定，用于HE 染色；余肝臟置于-80 ℃冰箱保存，用于PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平的測(cè)定及qRT-PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)。

2.4 觀察組織肝纖維化程度 采用HE 染色。將經(jīng)福爾馬林溶液固定后的肝臟組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE 染色，于顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟的肝纖維化程度。

2.5 血清生化指標(biāo)及炎癥因子檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、ALB 及TP 水平，采用ELISA 法測(cè)定血清中MMP-9 及IL-1β、IL-6 水平。

2.6 肝纖維化指標(biāo)測(cè)定 采用ELISA 法測(cè)定肝組織勻漿中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.7Col-Ⅰ、TNF-αmRNA 檢測(cè) TRIZOL 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1，由TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1 引物序列

2.8 檢測(cè)肝組織中NF-κB p65、IκBα 蛋白 采用Western blot 法。提取各組肝組織的總蛋白，微量核酸檢測(cè)儀進(jìn)行蛋白定量。取100 μL 蛋白樣品至EP 管中，加入5×SDS 上樣緩沖液25 μL，100 ℃煮10 min 進(jìn)行蛋白質(zhì)變性，冰上冷卻，置于-20 ℃冰箱保存。電泳采用10% SDS-PAGE 凝膠，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶于4 ℃封閉1 h，分別用NF-κB p65 抗體（1∶1 000），IκBα（1∶1 000），βactin 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，然后加入山羊抗兔-Ig G 抗體（1∶30 000）避光孵育1 h。將每個(gè)樣本所測(cè)得的NF-κB p65、IκBα 蛋白灰度值，分別與β-actin 蛋白的灰度值相比，計(jì)算灰度比值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（）表示，方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較應(yīng)用LSD 法；方差不齊則應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠生存狀況及肝組織病理觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，除對(duì)照組外其余各組大鼠均有死亡。其中，模型組死亡4 只，秋水仙堿組死亡1 只，白背葉根水提取物高劑量組死亡1只，白背葉根水提取物中劑量組死亡1 只，白背葉根水提取物低劑量組死亡3 只。HE 染色顯示，對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞未見腫脹及其他異常，未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維沉積。模型組大鼠肝臟假小葉形成明顯，肝索排列紊亂，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變等病態(tài)改變，部分肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，肝臟匯管區(qū)沉積大量膠原纖維。秋水仙堿組及白背葉根水提取物組肝組織損傷明顯改善，白背葉根水提取物低劑量組肝組織損傷較模型組有所減輕。見圖1。

3.2 大鼠血清AST、ALT、ALP、ALB 及TP 水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT 及ALP 水平升高，ALB、TP 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組大鼠血清中AST、ALT 及ALP 水平下降，高劑量組ALB、TP 水平上升（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2～3。

3.3 大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組肝組織中以上指標(biāo)水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3.4 大鼠血清中MMP-9、IL-1β、IL-6 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MMP-9、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量 組下調(diào)MMP-9、IL-1β、IL-6 水 平（P＜0.05）。見圖5～6。

3.5 大鼠肝臟指數(shù) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組及白背葉根水提取物中、高劑量組大鼠肝臟指數(shù)降低（P＜0.05）。見圖7。

3.6 肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 的表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿組和白背葉根水提取物中、高組抑制了大鼠肝組織中Col-Ⅰ和TNF-αmRNA 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖8。

圖1 HE 染色觀察各組大鼠肝組織病理改變（×100）

圖2 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠血清中AST、ALT 及ALP 的影響

圖3 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠血清中ALB、TP 的影響

3.7 肝組織中NF-κB p65 及IκBα 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組NF-κB p65 蛋白表達(dá)提高（P＜0.01），IκBα 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿和白背葉根水提取物中、高劑量組明顯降低NF-κB p65 蛋白表達(dá)（P＜0.01），提高IκBα 蛋白表達(dá)（P＜0.01）。見圖9～10。

圖4 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 水平的影響

圖5 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠血清中MMP-9 水平的影響

圖6 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠血清中IL-1β、IL-6 水平的影響

圖7 白背葉根水提取物對(duì)肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)的影響（）

4 討論

肝纖維化是多數(shù)慢性肝臟疾病發(fā)展進(jìn)程中的一個(gè)病理改變，若不及時(shí)干預(yù)則可導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌［4］。目前化學(xué)合成藥物對(duì)于肝纖維化的治療效果并不理想［5］，越來(lái)越多的學(xué)者開始對(duì)傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行研究，以期找到更好的治療肝纖維化藥物［6-8］，本研究擬對(duì)白背葉根治療肝纖維化的作用機(jī)制進(jìn)行探究。

圖8 白背葉根水提取物對(duì)肝組織中Col-Ⅰ和TNF-α mRNA 表達(dá)的影響

圖9 肝組織中NF-κBp65、IκBα 蛋白的表達(dá)水平

圖10 白背葉根水提取物對(duì)肝組織中NF-κBp65、IκBα蛋白表達(dá)水平的影響

CCl4常被用作誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷及肝纖維化，其經(jīng)代謝可以產(chǎn)生大量自由基，對(duì)肝細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的攻擊導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化［9］。肝臟受損后，ALB 及TP 合成功能受到影響，ALT、AST 和ALP 大量進(jìn)入血液［10］。肝細(xì)胞受損會(huì)導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放，進(jìn)一步促進(jìn)膠原的合成與積累［11］。PC-Ⅲ、Col-Ⅳ、HA、LN 常被臨床用以判斷肝纖維化程度，是肝纖維化改變的敏感指標(biāo)［12］。TNF-α 是一種強(qiáng)大的致炎因子，可聯(lián)合如IL-1β、IL-6 等細(xì)胞因子共同刺激肝星狀細(xì)胞活化，從而影響肝纖維化的啟動(dòng)與發(fā)生［13］。Col-Ⅰ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，可以代替血竇內(nèi)皮下間隙的基膜，因此對(duì)肝纖維化發(fā)展中起重要作用［14］。MMP-9 是調(diào)節(jié)肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶類之一，隨著肝纖維化程度的加深，機(jī)體代償性降解過(guò)度沉積的膠原纖維，使得MMP-9 水平增高［15］。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠相比，白背葉根水提取物組大鼠血清中ALT、AST、ALP、IL-1β、IL-6 和MMP-9 的水平顯著降低，ALB、TP的水平明顯提高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Col-Ⅰ及TNF-αmRNA 表達(dá)受到抑制，提示白背葉根水提取物可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)MMP-9 活性的途徑改善肝纖維化。

有研究表明［16］NF-κB 信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子來(lái)影響肝纖維化，其異常激活可導(dǎo)致機(jī)體免疫、炎癥及生長(zhǎng)反應(yīng)的相關(guān)基因表達(dá)異常［17］。NF-κB 家族由5 種亞基所組成（p50、p52、cRel、p65 /RelA 和RelB）［18］。靜息細(xì)胞中，p65/p50 異源二聚體與IκBα 在細(xì)胞質(zhì)中形成無(wú)活性三聚體，阻止了p65/p50 易位至細(xì)胞核［19］。當(dāng)肝臟受到各種刺激源刺激，致使IκB 激酶復(fù)合物磷酸化，導(dǎo)致IκBα蛋白降解，破壞了無(wú)活性三聚體，釋放p65/p50 異源二聚體易位至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)各種與肝纖維化相關(guān)的基因進(jìn)行表達(dá)，最終引起肝纖維化的啟動(dòng)與發(fā)展［20］。本研究表明白背葉根水提取物可以明顯抑制p65 及IκBα 蛋白的表達(dá)，提示白背葉根水提取物可以通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的途徑抑制肝臟炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其改善肝纖維化的作用。

綜上所述，白背葉根水提取物可以通過(guò)抑制CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝組織中p65 及IκBα 蛋白的表達(dá)，從而抑制NF-κB 信號(hào)通路激活，使機(jī)體炎癥反應(yīng)減輕，最終改善大鼠肝纖維化。但本研究缺少對(duì)NF-κB 信號(hào)通路正向及反向靶基因的研究，需進(jìn)一步探索以便更加深入的闡述白背葉根水提取物抗肝纖維化的機(jī)制。