張 依李 婷丁 越鄒純樸田娟娟張 彤?

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203）

芩麻方是國(guó)醫(yī)大師裘沛然教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)小青龍湯演變而來，主要由麻黃、黃芩、甘草等7 味中藥組成，具有寒熱并用、斂散相伍的配伍特征，主治寒邪痰熱內(nèi)蘊(yùn)之哮喘、咳嗽，臨床上主要用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎等病癥［1］，該方臨床使用已有四十多年，具有較好的療效和安全性。支氣管哮喘作為一種最常見的慢性呼吸道疾?。?-3］，其治療不僅消耗了大量衛(wèi)生資源，而且因勞動(dòng)力喪失導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前全球約有3 億患者，所造成的疾病負(fù)擔(dān)占全球所有疾病傷殘調(diào)整生命年的1%，與糖尿病相當(dāng)［4］，其特征是反復(fù)發(fā)作的呼吸困難和喘息，嚴(yán)重程度和發(fā)生頻率因人而異［5-6］。目前，臨床治療支氣管哮喘以激素藥物治療為主，如糖皮質(zhì)激素、β2-受體激動(dòng)劑、白三烯受體拮抗劑、茶堿類藥物等［7-8］，這些藥物雖然起效快，但存在許多副作用及不良反應(yīng)，不適合長(zhǎng)期服用；芩麻方臨床上表現(xiàn)出長(zhǎng)效、低毒、副作用少等優(yōu)勢(shì)［9］，故按照中藥現(xiàn)代化的要求將芩麻方其成攜帶、服用方便的顆粒劑，將有利于該類疾病的治療。

芩麻方中主要成分為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、沒食子酸、黃芩苷、龍膽苦苷等［10-13］，其中黃芩苷具有治療支氣管哮喘、抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)作用［14-15］。因此，故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法測(cè)定芩麻顆粒中黃芩苷含有量，不僅考察了該成分提取方法，并比較了不同品牌、材質(zhì)微孔濾膜對(duì)黃芩苷的吸附作用，以及高速離心、微孔濾膜濾過法對(duì)黃芩苷的前處理效果，為該制劑后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 黃芩（產(chǎn)地山西，批號(hào)161122）、麻黃（產(chǎn)地內(nèi)蒙，批號(hào) 160812）、甘草（產(chǎn)地甘肅，批號(hào)161215）、干姜（產(chǎn)地山東，批號(hào)161117）、龍膽（產(chǎn)地云南，批號(hào)160906）、細(xì)辛（產(chǎn)地遼寧，批號(hào)161216）、訶子（產(chǎn)地廣西，批號(hào)161220）均購(gòu)于上海虹橋中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心宋龍博士鑒定為正品。

1.2 試劑與藥物 芩麻顆粒（批號(hào)171203）由中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)中試（孵化）基地生產(chǎn)。黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110715-200815，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.5%）。0.45 μm 尼龍微孔濾膜和0.45 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司、迪馬科技有限公司、美國(guó)安捷倫科技公司、天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、天津萊博飛特生物科技有限公司、上海泰坦科技股份有限公司。甲醇為色譜純（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；95%乙醇、無水乙醇、甲醇、磷酸均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為雙蒸餾水。

1.3 儀器 BS124S 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JA5002 電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Agilent Technologies 1200 Series 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；TGL-16B 低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DZF-6050 真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SB-5200D 超聲波清洗機(jī)（寧波新藝生物科技股份有限公司）；HHS 電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷含有量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，75%甲醇制成高（339.6 μg/mL）、中（33.96 μg/mL）、低（3.396 μg/mL）質(zhì)量濃度的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，冷卻至室溫后75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，15 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.1.3 色譜條件 迪馬-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.3% 磷酸（B），等度洗脫（50∶50）25 min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，黃芩苷能與其他組分完全分離（R≥1.5），理論塔板數(shù)按該成分色譜峰計(jì)不低于2 500。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取黃芩苷對(duì)照品溶液適量，75%甲醇稀釋成325.4、260.3、195.2、130.2、65.08、32.54、13.02、6.508、3.254 μg/mL，各精密吸取10 μL，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=36.871X-60.518（r=0.999 7），在3.254～325.4 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 黃芩苷HPLC 色譜圖

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取高、中、低質(zhì)量濃度的黃芩苷對(duì)照品溶液各10 μL，同一天內(nèi)在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，日內(nèi)、日間精密度RSD 分別小于1.0%、0.9%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取顆粒適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷含有量RSD 為0.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷峰面積RSD 為1.3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取黃芩苷含有量已知的顆粒，分別加入相當(dāng)于該成分含有量80%、100%、120% 的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2 前處理工藝優(yōu)化

2.2.1 顆粒研磨 顆粒研磨成細(xì)粉（過80 目篩），取約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、25 kHz）提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，收集提取液；另取顆粒，不研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，同法處理，15 000 r/min 離心10 min，測(cè)定黃芩苷含有量，結(jié)果見表2。由此可知，顆粒研磨前后黃芩苷含有量無明顯變化，可能是該成分在50% 甲醇中溶解性較好，但考慮到顆粒研磨過程中容易吸潮，稱量操作不便，故選擇不研磨而直接提取。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

表2 顆粒研磨對(duì)黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.2 提取方法 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入100 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，分別超聲、回流、60 ℃水浴熱浸提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，收集提取液，15 000 r/min離心10 min，測(cè)定黃芩苷含有量，結(jié)果見表3。由此可知，超聲、回流提取下黃芩苷含有量高于熱浸法，但兩者無明顯差異，故選擇操作更簡(jiǎn)便的超聲提取。

表3 提取方法對(duì)黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.3 提取溶劑種類 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入水、乙醇、甲醇、25% 甲醇、50%甲醇、75%甲醇各100 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測(cè)定黃芩苷含有量，結(jié)果見表4。由此可知，75%甲醇提取時(shí)黃芩苷含有量最高，故選擇該溶劑。

2.2.4 提取溶劑體積 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50、100、250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入10、25、50、100 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，平行3 份，冷卻至室溫后50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測(cè)定黃芩苷含有量，結(jié)果見表5。由此可知，25 mL 提取時(shí)黃芩苷含有量最高，故選擇該體積。

表4 提取溶劑種類對(duì)黃芩苷含有量的影響（n＝3）

表5 提取溶劑體積對(duì)黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.2.5 提取時(shí)間 取顆粒約0.2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 75%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲提取5、10、20、30、60 min，平行3 份，冷卻至室溫后50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，收集提取液，15 000 r/min 離心10 min，測(cè)定黃芩苷含有量，結(jié)果見表6。由此可知，提取20 min 后黃芩苷含有量無明顯變化，考慮到效率因素，故選擇提取時(shí)間20 min。

表6 提取時(shí)間對(duì)黃芩苷含有量的影響（n＝3）

2.3 提取液除雜 采用HPLC 法測(cè)定提取液中成分含有量時(shí)，一般需采用微孔濾膜或超速離心去除懸浮粒子，以免堵塞色譜柱。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，微孔濾膜處理顆粒提取液時(shí)對(duì)黃芩苷具有一定吸附性，而且不同材質(zhì)的吸附性有所差異，故有必要比較微孔濾膜、超速離心的處理效果，以及兩者對(duì)黃芩苷吸附性的影響。

取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，15 000 r/min 離心10 min；另取2 種溶液適量，經(jīng)不同品牌、材料0.45 μm 微孔濾膜過濾，測(cè)定黃芩苷含有量，計(jì)算其轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖2，可知迪馬科技有限公司所生產(chǎn)的0.45 μm 尼龍微孔濾膜，以及上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司、安捷倫科技有限公司所生產(chǎn)的0.45 μm聚四氟乙烯微孔濾膜對(duì)黃芩苷的吸附最少；同一品牌中，聚四氟乙烯濾膜對(duì)該成分的吸附明顯少于尼龍濾膜。另外，與微孔濾膜法相比，高速離心法所得黃芩苷的轉(zhuǎn)移率較高，故提取液前處理方法可采用該方法；如果采用微孔濾膜法，則可選擇上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司、安捷倫科技有限公司所生產(chǎn)的0.45 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜進(jìn)行過濾。

圖2 不同品牌、材料0.45 μm 微孔濾膜對(duì)黃芩苷轉(zhuǎn)移率的影響

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在處理芩麻顆粒提取液時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同廠家、材料的0.45 μm 微孔濾膜對(duì)黃芩苷均有一定吸附性，故考察了不同品牌尼龍濾膜，以及同一品牌尼龍、聚四氟乙烯濾膜對(duì)該成分的吸附效果，發(fā)現(xiàn)由迪馬科技有限公司生產(chǎn)的尼龍濾膜吸附量較小，成分轉(zhuǎn)移率為81.76%～96.57%；聚四氟乙烯濾膜的吸附率相對(duì)較低，以安捷倫科技有限公司、上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司生產(chǎn)的最明顯，成分轉(zhuǎn)移率均高于95%。然后，將33.96 μg/mL 黃芩苷對(duì)照品溶液經(jīng)天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、天津萊博飛特生物科技有限公司生產(chǎn)的0.45 μm 尼龍微孔濾膜過濾，發(fā)現(xiàn)吸附率分別為37.60%、48.44%，2 倍體積甲醇洗脫后其回收率分別為93.05%、90.44%，進(jìn)一步證明了以上2 個(gè)品牌較強(qiáng)的吸附性。目前，市場(chǎng)上有機(jī)相微孔濾膜的材料大多以尼龍為主，提示研究人員在進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)時(shí)需要關(guān)注微孔濾膜對(duì)目標(biāo)成分的吸附作用，從而選擇更合適的提取液除雜方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)不僅優(yōu)化了芩麻顆粒前處理工藝，并成功建立其主要成分黃芩苷含有量的測(cè)定方法。同時(shí)，還首次發(fā)現(xiàn)微孔濾膜對(duì)芩麻顆粒中黃芩苷的吸附作用，并對(duì)目前市面上常見的微孔濾膜進(jìn)行評(píng)估，為相關(guān)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。