孟 璐丁琮洋徐帥師楊浩天李 穎董占軍 ?

（1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051）

湯劑作為我國傳統(tǒng)的一種用藥劑型，其本身具有制備簡單易行、吸收快、根據(jù)病情適當(dāng)加減、靈活運(yùn)用，能迅速發(fā)揮藥效等優(yōu)點(diǎn)。但其本身也存在煎煮液量大、攜帶不方便、易發(fā)霉發(fā)酵不能長久儲存等缺點(diǎn)［1］。中藥配方顆粒是由中藥飲片提取、濃縮、干燥、制粒而成的，具有無需煎煮、攜帶保存與服用方便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上使用越來越廣泛［2-3］。四物湯收載于《太平惠民合劑局方》，是中醫(yī)補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)、養(yǎng)血經(jīng)典的方藥，是由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎4 味藥組成，主要成分包括糖苷類、有機(jī)酸類、生物堿類、多糖、微量元素跟揮發(fā)油等。近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)四物湯可改善冠心病心絞痛癥狀，降低血脂，改善心功能［4］；保護(hù)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞［5］；改善衰老代謝紊亂［6］；增加骨量、降低炎癥反應(yīng)程度，促進(jìn)骨折恢復(fù)［7-8］。目前對于四物湯湯劑與配方顆粒之間多種有效成分含有量比較的報(bào)道較少［9-10］，本實(shí)驗(yàn)對四物湯傳統(tǒng)飲片湯劑與中藥配方顆粒中的沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含有量進(jìn)行比較，考察2 種劑型中有效成分含有量的等量性，以探討中藥配方顆粒在中藥配伍中應(yīng)用的可行性。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀（包括四元溶劑管理器、樣品管理器FTN、二極管陣列檢測器、Empower 3 色譜工作站，美國Waters公司）；AB204-S 標(biāo)準(zhǔn)型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；TGL-16 高速離心機(jī)（山東百歐醫(yī)療科技有限公司）；KR-360B 型超聲清洗器（科爾超聲波設(shè)備有限公司）。

對照品綠原酸（批號110753-200413）、咖啡酸（批號110885-200102）、阿魏酸（批號110773-201614）、沒食子酸（批號110831-201605）、芍藥苷（批號110736-201842）、毛蕊花糖苷（批號111530-201713）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎由廣東一方制藥有限公司提供，由河北省人民醫(yī)院董占軍主任藥師鑒定為正品。配方顆粒，熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎由廣東一方制藥有限公司提供。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司），Millipore 超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方及湯劑制備

2.1.1 處方組成 熟地黃12 g、當(dāng)歸10 g、白芍12 g、川芎8 g。

2.1.2 傳統(tǒng)湯劑制備 按處方比例稱取以上4味藥材，加溫水250 mL，浸泡30 min，之后煎煮45 min，濾過；藥渣加水 200 mL，煎煮30 min，濾過，合并2 次所得藥液，定容至300 mL，備用。

2.1.3 配方顆粒湯劑制備 取與藥材相當(dāng)量的4味配方顆粒，混合，加入80～100 ℃左右的水200 mL 攪拌溶解，超聲處理（360 W，40 kHz）10 min，放冷后加水至300 mL，備用。

2.2 有效成分含有量測定

2.2.1 色譜條件 依利特SinoChrom ODB-BP 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，1%～5% A；5～10 min，5%～8% A；10～15 min，8%～10% A；15～19 min，10%～15% A；19～23 min，15%A；23～30 min，15%～20% A；30～40 min，20%A）；體積流量0.8 mL/min；檢測波長215 nm（沒食子酸），230 nm（芍藥苷），330 nm（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷對照品適量，以甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.780、1.124、0.750、0.654、0.491、0.500 g/L的對照品貯備液。

2.2.3 供試品溶液制備 取四物湯湯劑與配方顆粒湯劑溶液適量，12 000 r/min 離心10 min，分別取各自上清液300 μL 過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各5 μL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜圖見圖1，樣品中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷色譜峰的保留時(shí)間與對照品一致。各成分色譜峰能達(dá)到較好的分離，且樣品中其他成分對待測成分的測定無干擾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別取沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷貯備液適量，加甲醇逐級稀釋制成一系列6 個(gè)梯度質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以待測組分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液5 μL，在“2.2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，計(jì)算得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的峰面積RSD 值分別為1.4%、1.7%、1.3%、1.5%、1.6%、1.5%。表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一湯劑（飲片湯劑）6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法，平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.032、0.017、0.004、0.253、0.031、0.006 g/L，RSD 分別為1.5%、1.1%、1.1%、1.0%、0.3%、1.7%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5 μL（飲片湯劑），在“2.2.1”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的RSD 分別為1.8%、1.5%、1.0%、1.4%、0.3%、1.5%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的四物湯（湯劑飲片）6 份，每份1.0 mL，精密稱定，分別精密加入混合對照品0.1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。測得沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為 99.01%、96.93%、96.81%、96.97%、97.32%、97.65%，RSD 分別為1.08%、1.58%、1.48%、1.52%、0.81%、1.40%。

2.2.10 樣品含有量測定 取四物湯飲片湯劑與配方顆粒湯劑各3 批，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，在“2.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，并計(jì)算各樣品中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（μg/mL）Tab.2 Results of content determination of various constituents（μg/mL）

3 討論

3.1 波長選擇 本實(shí)驗(yàn)通過PDA 檢測器在200～400 nm 進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸在215 nm波長處有最大吸收，芍藥苷在230 nm 處有最大吸收，為了兼顧其余4 種有效成分的最大吸收并具備良好的基線水平，故選擇330 nm 為綠原酸、咖啡酸、阿魏酸與毛蕊花糖苷的檢測波長。

3.2 流動相選擇 由于分析對象是復(fù)方湯劑，其所含化學(xué)成分復(fù)雜，且所測的6 種成分極性相差較大，采用等度洗脫難以達(dá)到有效分離，故采用梯度洗脫。有文獻(xiàn)［11-12］表明流動相內(nèi)加入磷酸可以使各組分得到較好的分離，經(jīng)過反復(fù)摸索，確定流動相為乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)，梯度洗脫，在流動相內(nèi)加入0.1%磷酸能夠使各組分色譜峰得到較好的分離，得到較佳峰形，并且基線穩(wěn)定。

3.3 含有量差異分析 本研究建立了HPLC 法同時(shí)測定四物湯中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷6 種指標(biāo)成分含有量的方法，考察了四物湯傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒間指標(biāo)成分含有量的差異。結(jié)果表明，在2 種湯劑中，均可檢測出這6 種有效成分，但在湯劑中的有效成分含有量除了沒食子酸，其余5 種所測有效成分含有量均高于其相同批號制得的配方顆粒中有效成分的含有量，對于同一批藥材所制的湯劑與配方顆粒湯劑其有效成分不等量。這幾種有效成分含有量差異較大，其中含有量較大的成分為沒食子酸、阿魏酸和芍藥苷，可能是其均為水溶性成分，易于從藥材中提取出來［13］。在3 批飲片湯劑中其有效成分含有量上下幅度也較大，考慮到飲片湯劑采用傳統(tǒng)的煎煮制備法，受到煎煮時(shí)間、次數(shù)、加水量、對火候控制等一系列因素的影響，導(dǎo)致其有效成分溶出量受其影響波動較大，而配方顆粒生產(chǎn)的機(jī)械化程度要高于傳統(tǒng)飲片湯劑，具有一系列標(biāo)準(zhǔn)化穩(wěn)定的的生產(chǎn)制備工藝，可以有效避免這些影響因素，保證了藥物質(zhì)量的穩(wěn)定，在所測的3 批配方顆粒湯劑中其指標(biāo)成分含有量也較穩(wěn)定、上下含有量變化幅度小。但其在生產(chǎn)過程中，由于每個(gè)制備環(huán)節(jié)也會對顆粒質(zhì)量產(chǎn)生影響，機(jī)械設(shè)備不能完全滿足配方顆粒的機(jī)械化生產(chǎn)，制備生產(chǎn)工藝有待進(jìn)一步完善和提升，以保證湯劑與配方顆粒二者之間質(zhì)量的穩(wěn)定性與均一性［14］。中藥所含成分相當(dāng)復(fù)雜，其在煎煮過程中各類成分也會產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)變化，它的藥理作用是一個(gè)綜合起效的過程，不能僅以一種或幾種有效成分不等量來進(jìn)行評價(jià)，還需從藥效學(xué)和患者服用后最終臨床療效，從臨床應(yīng)用方面入手進(jìn)行分析，二者在臨床療效上是否有差異，進(jìn)而得到驗(yàn)證。