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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究甘麥大棗湯改善睡眠障礙的作用機(jī)制

        2020-05-12 13:37:20晏仁義陳襯心李赫宇張東星張於洪建鄭艷超
        中成藥 2020年2期
        關(guān)鍵詞:甘麥靶標(biāo)大棗

        晏仁義陳襯心李赫宇張東星張 民?於洪建鄭艷超

        (1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司,天津 300457)

        睡眠障礙是指在睡眠時(shí)間和機(jī)會(huì)充足的情況下,發(fā)生反復(fù)入睡、睡眠維持與鞏固、睡眠質(zhì)量差等困難,導(dǎo)致患者日間功能受損。眾所周知,良好的睡眠是人體健康的基石,缺乏高質(zhì)量的睡眠會(huì)對(duì)人體器官造成不可逆的損傷。近年來隨著人們工作節(jié)奏的不斷加快,生活壓力的不斷加大,睡眠障礙的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。據(jù)北京朝陽醫(yī)院發(fā)布的 《2018 中國睡眠質(zhì)量調(diào)查報(bào)告》顯示,在10 萬被調(diào)查人群中有83.81%經(jīng)常受到睡眠問題困擾。睡眠障礙會(huì)令人疲憊、記憶減退,且頭痛、目眩等癥狀同時(shí)出現(xiàn),嚴(yán)重影響身體健康、生活質(zhì)量[1]。西藥治療多采用巴比妥類、苯二氮卓類等鎮(zhèn)靜安眠藥,但這些藥物會(huì)產(chǎn)生依賴、戒斷、宿醉等不良反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)注重整體觀,具有豐富的理論與實(shí)踐基礎(chǔ),且不良反應(yīng)少,因而受廣泛關(guān)注。

        甘麥大棗湯出自 《金匱要略》,由甘草、小麥、大棗組成,3 味藥均為常見的藥食同源中藥。臨床和食療上,甘麥大棗湯用于調(diào)理睡眠障礙相關(guān)的精神類疾病,主治情志不舒、思慮過度、躁擾不寧的臟躁癥[2]。邵圓[3]采用隨機(jī)抽取方法對(duì)門診產(chǎn)后女性睡眠障礙進(jìn)行觀察,給予甘麥大棗湯治療2 周后,患者的匹茲堡睡眠表評(píng)分有所改善,糾正了抑郁狀態(tài)。李先曉等[4]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),應(yīng)用甘麥大棗湯合酸棗仁湯加減可有效改善更年期患者的失眠癥狀?,F(xiàn)代研究[5]表明甘麥大棗湯具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗抑郁等藥理作用,但目前對(duì)甘麥大棗湯中的化學(xué)成分及如何發(fā)揮治療睡眠障礙的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在多基因、多通路、多途徑的多層次網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上,用于從整體研究中藥,具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6]。故本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討甘麥大棗湯改善睡眠障礙主要活性成分和作用機(jī)制。

        1 方法

        1.1 目標(biāo)化合物的收集 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/),提取甘草、大棗、小麥中化學(xué)成分,以口服生物利用度(Oral bioavailabiliy,OB)≥20% 和類藥性(Drug-likeness,DL)≥0.18% 作為活性成分篩選條件,同時(shí)結(jié)合2015 年版《中國藥典》 及文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)具有藥理活性的化學(xué)成分提取。

        1.2 目標(biāo)化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫提取活性成分的作用靶點(diǎn),將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)獲得靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名稱?;蛲ㄟ^PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)提取活性成分的結(jié)構(gòu),導(dǎo)入Swiss 數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲得靶點(diǎn)的基因名稱。

        1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

        1.3.1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將化合物和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)整合到Excel 表格中,利用Cytoscape軟件繪制甘麥大棗湯的活性成分-靶點(diǎn)的(Component-Target,C-T)網(wǎng)絡(luò)圖。

        1.3.2 睡眠障礙相關(guān)靶點(diǎn)收集 將“Sleep disorders”關(guān)鍵詞輸入 到DrugBank(https://www.drugbank.ca)數(shù)據(jù)庫中,對(duì)調(diào)控睡眠障礙的基因進(jìn)行檢索,得到共計(jì)174 個(gè)作用靶點(diǎn)。

        1.3.3 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將甘麥大棗湯活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),睡眠障礙對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BioGRID 數(shù)據(jù)庫(https://thebiogrid.org/),構(gòu)建睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分別導(dǎo)入Cytoscape 軟件,運(yùn)用Merge 將睡眠障礙靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)與甘麥大棗湯化學(xué)成分蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)起來,采用Network analysis 對(duì)網(wǎng)絡(luò)表征進(jìn)行分析,獲取蛋白相互作用關(guān)系,保存CSV 格式文件,并提取degree>4作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

        采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫(http://davki.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp,version 6.7)對(duì)甘麥大棗湯作用于睡眠障礙的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物通路分析,選擇P<0.05,作為與靶點(diǎn)密切相關(guān)的重要作用通絡(luò),使用Omicshare(https://www.omicshare.com/tools/Home/index/index.html)對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化,分析甘麥大棗湯治療睡眠障礙的可能作用機(jī)制。

        根據(jù)DAVID 數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵通路中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),及靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)化學(xué)成分,構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”Excel 表格,運(yùn)用Cytoscape 軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標(biāo)相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。

        2 結(jié)果

        2.1 活性化學(xué)成分的篩選 以O(shè)B ≥20% 且DL≥0.18為篩選條件,同時(shí)結(jié)合藥典及文獻(xiàn)報(bào)道的主要成分,有些成分雖不符合要求,但文獻(xiàn)報(bào)道具有較強(qiáng)的相關(guān)藥理活性,本研究也將其納入活性成分,如甘草酸苷、異甘草素、刺甘草查爾酮等[7-9]。通過篩選,最終獲得127 個(gè)化合物(甘草95 個(gè),小麥9 個(gè),大棗23 個(gè))。且不同藥材之間所含化合物有重疊,如甘草、大棗中都含有C3(白樺脂酸)、C7(齊墩果酸)、C95(槲皮素)等5 個(gè)化合物。有研究報(bào)道,甘草中甘草次酸能促進(jìn)大腦分泌內(nèi)源性物質(zhì),從而改善睡眠作用[10];大棗水提取物可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)內(nèi)源性物質(zhì)分泌,改善睡眠[11]。

        表1 各化合物信息Tab.1 Information of various compounds

        續(xù)表1

        續(xù)表1

        2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將篩選出的活性成分和靶點(diǎn)相連構(gòu)建(C-T)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。圖中共涉及365 個(gè)節(jié)點(diǎn)(127 種化學(xué)成分和238 個(gè)靶點(diǎn))。不同形狀的節(jié)點(diǎn)分別代表活性成分和靶點(diǎn),圓形代表作用靶點(diǎn),V 節(jié)點(diǎn)代表活性成分,邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡(luò)中,degree 值可反映節(jié)點(diǎn)的重要性,其中degree 值排名靠前的化合物中甘草成分主要有山柰酚(degree=50)、甘草查爾酮A(degree=31)、異甘草 素(degree=29)、甘草素(degree=10)、甘草次酸(degree=6)等;小麥中主要有谷胱甘肽(degree=15)、玉米黃質(zhì)(degree=15)、豆甾醇(degree=15)等;大棗中主要有β-胡蘿卜素(degree=22)、兒茶素(degree=18)、西托糖苷(degree=16)等。

        2.3 睡眠障礙靶點(diǎn)收集 對(duì)調(diào)控睡眠障礙相關(guān)的基因在DrugBank 數(shù)據(jù)檢索收集,共有174 個(gè)與睡眠障礙相關(guān)的疾病靶標(biāo)用于網(wǎng)絡(luò)分析,與睡眠障礙相關(guān)的靶標(biāo)信息,見圖2。

        2.4 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將甘麥大棗湯化學(xué)成分相互作用網(wǎng)絡(luò)和睡眠障礙相互作用網(wǎng)絡(luò)互作之后的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫,對(duì)甘麥大棗湯治療睡眠障礙121 關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 生物通路富集分析。選擇P<0.05,篩選排名靠前的關(guān)鍵通路,用基因個(gè)數(shù)、P值和Rich factor 來衡量KEGG 富集程度,見圖3。Rich factor 是目標(biāo)基因集中在這個(gè)通路的基因數(shù)量/背景基因集中在這個(gè)通路的基因數(shù)量,且Rich factor越大,表示富集程度越高。研究發(fā)現(xiàn),靶點(diǎn)主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號(hào)通路,采用Cytoscape軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標(biāo)-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標(biāo)相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖4。

        3 討論

        圖3 通路富集氣泡圖Fig.3 Pathway enrichment bubble diagram

        本文對(duì)甘麥大棗湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)degree 值較高的化合物包括3 個(gè)黃酮類,分別為山柰酚(degree=50)、甘草查爾酮A(degree=31)、異甘草素(degree=29);肽類化合物谷胱甘肽(degree=15);萜類化合物β-胡蘿卜素(degree=22)。有文獻(xiàn)報(bào)道,山奈酚能改善腦缺血大鼠的海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu),具有神經(jīng)保護(hù)作用,改善認(rèn)知功能障礙[12-13]。谷胱甘肽是一種具有重要生物活性的天然活性肽,在神經(jīng)系統(tǒng)中,作為一種輔酶因子充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì),抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)而發(fā)揮作用[14-15]。β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑,膳食攝入可以降低阿爾茨海默病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[16]。

        圖4 成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Component-target-pathway network

        本研究基于甘麥大棗湯化學(xué)成分238 個(gè)靶點(diǎn)和睡眠障礙174 個(gè)靶點(diǎn)互作,預(yù)測甘麥大棗湯治療睡眠障礙的主要作用靶點(diǎn)。通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),GSK3B(degree=14)、CALM1(degree=13)、MAPK14(degree=13)、AKT1(degree=12)、MAPK1(degree=12)、ESR2(degree=11)等中心度較高的靶點(diǎn)。有研究報(bào)道,GSK3B 是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與大腦神經(jīng)元的再生過程[17]。周彩鳳[18]以四動(dòng)脈結(jié)扎全腦缺血模型,研究延后性腦缺血后處理介導(dǎo)的大鼠海馬CA1 區(qū)Akt/GSK3B 信號(hào)介導(dǎo)通路,發(fā)現(xiàn)延遲性腦缺血后處理能夠誘導(dǎo)線粒體內(nèi)GSK3B 磷酸化水平升高。MAPK1 和MAPK14 均是絲氨酸/蘇氨酸激酶,MAP 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分。甘草總黃酮通過MAPKs 中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)ERK 信號(hào)通路,抑制iNOS和COX-2 基因和蛋白的表達(dá),而起到抗炎效果[19]。AKT1 是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一,磷酸化后AKT 活化,進(jìn)一步激活或抑制下游mTOR、GSK 等,參與調(diào)控細(xì)胞存活、生長、代謝[20]。在成人神經(jīng)發(fā)生過程中,AKT 是AKT-mTOR 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,控制新生神經(jīng)元整合過程的節(jié)奏,包括神經(jīng)元的正確定位、樹突發(fā)育和突觸形成。ESR1 是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子,是雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)生物學(xué)效應(yīng)的主要介導(dǎo)者[21]。研究發(fā)現(xiàn),ESR1 在MAPK/ERK 和PI3K/AKT 信號(hào)通路中,可迅速激活生長因子相關(guān)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力[22]。

        KEGG 生物通路富集分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號(hào)通路。HIF-1 信號(hào)通路是機(jī)體應(yīng)對(duì)缺氧時(shí),在機(jī)體形成復(fù)雜的反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用,其HIF-1α 是唯一一個(gè)特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子,參與了PI3K/AKT/HIF-1α、MAPK/HIF-1α 等多條細(xì)胞信號(hào)通路,是介導(dǎo)缺氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞[23]。ErbB 信號(hào)通路是參與編碼髓鞘蛋白,促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成,保證神經(jīng)系統(tǒng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)[24]。在神經(jīng)系統(tǒng)中,ErbB 與NRG1 結(jié)合后,胞內(nèi)發(fā)生自身酪氨酸磷酸化,并激活下游的Ras/MAPK、PI3K/AKT[25]。甘草查爾酮A 通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路而抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞自噬[26]。雌激素可以通過調(diào)節(jié)5-HT、GABA、NA、多巴胺等覺醒神經(jīng)遞質(zhì),可間接影響睡眠-覺醒周期,改變睡眠模式[27]。

        綜上所述,本研究用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了甘麥大棗湯配方的主要活性成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)、相關(guān)疾病及作用生物通路。結(jié)果篩選到127 個(gè)化合物,174 個(gè)與睡眠障礙相關(guān)的靶點(diǎn),靶點(diǎn)主要對(duì)應(yīng)10 條生物通路,為進(jìn)一步深入探究其作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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