晏仁義陳襯心李赫宇張東星張 民?於洪建鄭艷超

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457；2.天津益倍生物科技集團有限公司，天津 300457）

睡眠障礙是指在睡眠時間和機會充足的情況下，發(fā)生反復入睡、睡眠維持與鞏固、睡眠質(zhì)量差等困難，導致患者日間功能受損。眾所周知，良好的睡眠是人體健康的基石，缺乏高質(zhì)量的睡眠會對人體器官造成不可逆的損傷。近年來隨著人們工作節(jié)奏的不斷加快，生活壓力的不斷加大，睡眠障礙的發(fā)病率也呈上升趨勢。據(jù)北京朝陽醫(yī)院發(fā)布的 《2018 中國睡眠質(zhì)量調(diào)查報告》顯示，在10 萬被調(diào)查人群中有83.81%經(jīng)常受到睡眠問題困擾。睡眠障礙會令人疲憊、記憶減退，且頭痛、目眩等癥狀同時出現(xiàn)，嚴重影響身體健康、生活質(zhì)量［1］。西藥治療多采用巴比妥類、苯二氮卓類等鎮(zhèn)靜安眠藥，但這些藥物會產(chǎn)生依賴、戒斷、宿醉等不良反應。中醫(yī)學注重整體觀，具有豐富的理論與實踐基礎，且不良反應少，因而受廣泛關(guān)注。

甘麥大棗湯出自 《金匱要略》，由甘草、小麥、大棗組成，3 味藥均為常見的藥食同源中藥。臨床和食療上，甘麥大棗湯用于調(diào)理睡眠障礙相關(guān)的精神類疾病，主治情志不舒、思慮過度、躁擾不寧的臟躁癥［2］。邵圓［3］采用隨機抽取方法對門診產(chǎn)后女性睡眠障礙進行觀察，給予甘麥大棗湯治療2 周后，患者的匹茲堡睡眠表評分有所改善，糾正了抑郁狀態(tài)。李先曉等［4］通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，應用甘麥大棗湯合酸棗仁湯加減可有效改善更年期患者的失眠癥狀。現(xiàn)代研究［5］表明甘麥大棗湯具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗抑郁等藥理作用，但目前對甘麥大棗湯中的化學成分及如何發(fā)揮治療睡眠障礙的作用機制尚不明確。網(wǎng)絡藥理學是建立在多基因、多通路、多途徑的多層次網(wǎng)絡基礎上，用于從整體研究中藥，具有獨特的優(yōu)勢［6］。故本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討甘麥大棗湯改善睡眠障礙主要活性成分和作用機制。

1 方法

1.1 目標化合物的收集 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/），提取甘草、大棗、小麥中化學成分，以口服生物利用度（Oral bioavailabiliy，OB）≥20% 和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18% 作為活性成分篩選條件，同時結(jié)合2015 年版《中國藥典》 及文獻報道對具有藥理活性的化學成分提取。

1.2 目標化合物作用靶點的預測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫提取活性成分的作用靶點，將靶點導入UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）獲得靶點對應的基因名稱?；蛲ㄟ^PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）提取活性成分的結(jié)構(gòu)，導入Swiss 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）獲得靶點的基因名稱。

1.3 網(wǎng)絡構(gòu)建及分析

1.3.1 活性成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 將化合物和對應靶點整合到Excel 表格中，利用Cytoscape軟件繪制甘麥大棗湯的活性成分-靶點的（Component-Target，C-T）網(wǎng)絡圖。

1.3.2 睡眠障礙相關(guān)靶點收集 將“Sleep disorders”關(guān)鍵詞輸入 到DrugBank（https：//www.drugbank.ca）數(shù)據(jù)庫中，對調(diào)控睡眠障礙的基因進行檢索，得到共計174 個作用靶點。

1.3.3 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 將甘麥大棗湯活性成分對應靶點，睡眠障礙對應靶點分別導入BioGRID 數(shù)據(jù)庫（https：//thebiogrid.org/），構(gòu)建睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡和甘麥大棗湯化學成分蛋白相互作用網(wǎng)絡。將睡眠障礙蛋白相互作用網(wǎng)絡和甘麥大棗湯化學成分蛋白相互作用網(wǎng)絡分別導入Cytoscape 軟件，運用Merge 將睡眠障礙靶點相互作用網(wǎng)絡與甘麥大棗湯化學成分蛋白相互作用網(wǎng)絡關(guān)聯(lián)起來，采用Network analysis 對網(wǎng)絡表征進行分析，獲取蛋白相互作用關(guān)系，保存CSV 格式文件，并提取degree＞4作為關(guān)鍵靶點。

采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（http：//davki.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp，version 6.7）對甘麥大棗湯作用于睡眠障礙的關(guān)鍵靶點進行生物通路分析，選擇P＜0.05，作為與靶點密切相關(guān)的重要作用通絡，使用Omicshare（https：//www.omicshare.com/tools/Home/index/index.html）對富集分析結(jié)果進行可視化，分析甘麥大棗湯治療睡眠障礙的可能作用機制。

根據(jù)DAVID 數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵通路中對應靶點，及靶點對應化學成分，構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標-關(guān)鍵通路”Excel 表格，運用Cytoscape 軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 活性化學成分的篩選 以OB ≥20% 且DL≥0.18為篩選條件，同時結(jié)合藥典及文獻報道的主要成分，有些成分雖不符合要求，但文獻報道具有較強的相關(guān)藥理活性，本研究也將其納入活性成分，如甘草酸苷、異甘草素、刺甘草查爾酮等［7-9］。通過篩選，最終獲得127 個化合物（甘草95 個，小麥9 個，大棗23 個）。且不同藥材之間所含化合物有重疊，如甘草、大棗中都含有C3（白樺脂酸）、C7（齊墩果酸）、C95（槲皮素）等5 個化合物。有研究報道，甘草中甘草次酸能促進大腦分泌內(nèi)源性物質(zhì)，從而改善睡眠作用［10］；大棗水提取物可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，促進內(nèi)源性物質(zhì)分泌，改善睡眠［11］。

表1 各化合物信息Tab.1 Information of various compounds

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 將篩選出的活性成分和靶點相連構(gòu)建（C-T）網(wǎng)絡圖（圖1）。圖中共涉及365 個節(jié)點（127 種化學成分和238 個靶點）。不同形狀的節(jié)點分別代表活性成分和靶點，圓形代表作用靶點，V 節(jié)點代表活性成分，邊代表活性成分和作用靶點間的相互關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡中，degree 值可反映節(jié)點的重要性，其中degree 值排名靠前的化合物中甘草成分主要有山柰酚（degree=50）、甘草查爾酮A（degree=31）、異甘草 素（degree=29）、甘草素（degree=10）、甘草次酸（degree=6）等；小麥中主要有谷胱甘肽（degree=15）、玉米黃質(zhì)（degree=15）、豆甾醇（degree=15）等；大棗中主要有β-胡蘿卜素（degree=22）、兒茶素（degree=18）、西托糖苷（degree=16）等。

2.3 睡眠障礙靶點收集 對調(diào)控睡眠障礙相關(guān)的基因在DrugBank 數(shù)據(jù)檢索收集，共有174 個與睡眠障礙相關(guān)的疾病靶標用于網(wǎng)絡分析，與睡眠障礙相關(guān)的靶標信息，見圖2。

2.4 “關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 將甘麥大棗湯化學成分相互作用網(wǎng)絡和睡眠障礙相互作用網(wǎng)絡互作之后的關(guān)鍵靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫，對甘麥大棗湯治療睡眠障礙121 關(guān)鍵靶點進行KEGG 生物通路富集分析。選擇P＜0.05，篩選排名靠前的關(guān)鍵通路，用基因個數(shù)、P值和Rich factor 來衡量KEGG 富集程度，見圖3。Rich factor 是目標基因集中在這個通路的基因數(shù)量/背景基因集中在這個通路的基因數(shù)量，且Rich factor越大，表示富集程度越高。研究發(fā)現(xiàn)，靶點主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號通路，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶標-關(guān)鍵通路”相關(guān)靶標相互作用所構(gòu)建的多層次多靶標網(wǎng)絡圖，見圖4。

3 討論

圖3 通路富集氣泡圖Fig.3 Pathway enrichment bubble diagram

本文對甘麥大棗湯化合物-靶點網(wǎng)絡進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)degree 值較高的化合物包括3 個黃酮類，分別為山柰酚（degree=50）、甘草查爾酮A（degree=31）、異甘草素（degree=29）；肽類化合物谷胱甘肽（degree=15）；萜類化合物β-胡蘿卜素（degree=22）。有文獻報道，山奈酚能改善腦缺血大鼠的海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，具有神經(jīng)保護作用，改善認知功能障礙［12-13］。谷胱甘肽是一種具有重要生物活性的天然活性肽，在神經(jīng)系統(tǒng)中，作為一種輔酶因子充當神經(jīng)遞質(zhì)，抑制氧化應激介導而發(fā)揮作用［14-15］。β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，膳食攝入可以降低阿爾茨海默病的發(fā)病風險［16］。

圖4 成分-靶標-通路網(wǎng)絡圖Fig.4 Component-target-pathway network

本研究基于甘麥大棗湯化學成分238 個靶點和睡眠障礙174 個靶點互作，預測甘麥大棗湯治療睡眠障礙的主要作用靶點。通過網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，GSK3B（degree=14）、CALM1（degree=13）、MAPK14（degree=13）、AKT1（degree=12）、MAPK1（degree=12）、ESR2（degree=11）等中心度較高的靶點。有研究報道，GSK3B 是一類在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與大腦神經(jīng)元的再生過程［17］。周彩鳳［18］以四動脈結(jié)扎全腦缺血模型，研究延后性腦缺血后處理介導的大鼠海馬CA1 區(qū)Akt/GSK3B 信號介導通路，發(fā)現(xiàn)延遲性腦缺血后處理能夠誘導線粒體內(nèi)GSK3B 磷酸化水平升高。MAPK1 和MAPK14 均是絲氨酸/蘇氨酸激酶，MAP 激酶信號轉(zhuǎn)導途徑的重要組成部分。甘草總黃酮通過MAPKs 中的細胞外信號調(diào)節(jié)ERK 信號通路，抑制iNOS和COX-2 基因和蛋白的表達，而起到抗炎效果［19］。AKT1 是3種密切相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一，磷酸化后AKT 活化，進一步激活或抑制下游mTOR、GSK 等，參與調(diào)控細胞存活、生長、代謝［20］。在成人神經(jīng)發(fā)生過程中，AKT 是AKT-mTOR 信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，控制新生神經(jīng)元整合過程的節(jié)奏，包括神經(jīng)元的正確定位、樹突發(fā)育和突觸形成。ESR1 是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，是雌激素及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)生物學效應的主要介導者［21］。研究發(fā)現(xiàn)，ESR1 在MAPK/ERK 和PI3K/AKT 信號通路中，可迅速激活生長因子相關(guān)的下游信號轉(zhuǎn)導，從而增強細胞增殖能力［22］。

KEGG 生物通路富集分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信號通路。HIF-1 信號通路是機體應對缺氧時，在機體形成復雜的反應機制中發(fā)揮重要作用，其HIF-1α 是唯一一個特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，參與了PI3K/AKT/HIF-1α、MAPK/HIF-1α 等多條細胞信號通路，是介導缺氧信號的轉(zhuǎn)導中樞［23］。ErbB 信號通路是參與編碼髓鞘蛋白，促進神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成，保證神經(jīng)系統(tǒng)功能正常運轉(zhuǎn)［24］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ErbB 與NRG1 結(jié)合后，胞內(nèi)發(fā)生自身酪氨酸磷酸化，并激活下游的Ras/MAPK、PI3K/AKT［25］。甘草查爾酮A 通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路而抑制腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲，可誘導腎癌細胞自噬［26］。雌激素可以通過調(diào)節(jié)5-HT、GABA、NA、多巴胺等覺醒神經(jīng)遞質(zhì)，可間接影響睡眠-覺醒周期，改變睡眠模式［27］。

綜上所述，本研究用網(wǎng)絡藥理學方法初步探討了甘麥大棗湯配方的主要活性成分、對應靶點、相關(guān)疾病及作用生物通路。結(jié)果篩選到127 個化合物，174 個與睡眠障礙相關(guān)的靶點，靶點主要對應10 條生物通路，為進一步深入探究其作用機制奠定了良好的基礎。