錢宏梁，潘志強(qiáng)，李 亞，錢楊楊，費敏紅，方肇勤

（上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203）

中醫(yī)證候是中醫(yī)學(xué)對疾病辨證論治的基礎(chǔ)與核心。一直以來，中醫(yī)學(xué)術(shù)界對證候的發(fā)生發(fā)展以及其物質(zhì)基礎(chǔ)開展了大量的探索工作。宏觀的中醫(yī)證候與微觀世界的物質(zhì)分子中找到特異性的關(guān)聯(lián)和方向性的變化是中醫(yī)證候研究的目標(biāo)。這對于中藥以及中藥復(fù)方改善證候的調(diào)控靶點與“證-藥-效”的關(guān)系都有基礎(chǔ)性的作用。隨著中西醫(yī)結(jié)合治療模式在國內(nèi)普遍開展，人們發(fā)現(xiàn)許多西藥在治療疾病的同時也造成了固定的一系列方向性的新癥狀或異常體征，稱之為藥源性證候［1］。

氫化可的松是臨床常用的糖皮質(zhì)激素藥物，具有抗炎、免疫抑制、抗毒和抗休克等作用，因其分子結(jié)構(gòu)最接近生理狀態(tài)下的可的松，且不需要在肝臟轉(zhuǎn)化即可發(fā)揮較強(qiáng)的藥理作用，在臨床被廣泛運用。但是，客觀上臨床長期較大劑量使用氫化可的松等激素類藥物會引起多種不良反應(yīng)。因此，本研究選擇氫化可的松予以誘發(fā)藥源性證候。檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)術(shù)界既往研究認(rèn)為氫化可的松可以復(fù)制腎陰虛證、腎陽虛證，然而其證候?qū)傩砸蚪o藥劑量及給藥時間差異仍具有爭議性。此外，從西醫(yī)疾病模型分析，氫化可的松可作為典型的免疫抑制模型［2-3］?；谡n題組前期深入研究發(fā)現(xiàn)氫化可的松可誘發(fā)小鼠藥源性虛證，證候兼有氣虛、陽虛、陰虛，涉及腎藏象、脾藏象，本研究選用六味地黃丸、桂附地黃丸（金匱腎氣丸）2個經(jīng)典補(bǔ)腎方劑和四君子湯這個基礎(chǔ)益氣健脾方劑干預(yù)氫化可的松藥源性證候模型小鼠，并從小鼠證候信息、腎上腺皮質(zhì)與髓質(zhì)功能予以評價補(bǔ)腎、健脾治法的藥效。

1 材料

1.1 動物 雄性ICR 小鼠，SPF 級，80 只，體質(zhì)量（20～22）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房。動物許可證號SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物與試劑 氫化可的松（hydrocortisone 批號66003632），白色結(jié)晶粉末，分子量362.46，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。四君子湯、六味地黃湯、桂附地黃湯分別依據(jù)2015 年版《中國藥典》 的四君子丸［黨參200 g、白術(shù)（炒）200 g、茯苓200 g、炙甘草100 g、生姜50 g、大棗100 g］、六味地黃丸［熟地黃160 g、山茱萸（制）80 g、牡丹皮60 g、山藥80 g、茯苓60 g、澤瀉60 g］、桂附地黃丸［肉桂20 g、附子（制）20 g、熟地黃160 g、酒萸肉80 g、牡丹皮60 g、山藥80 g、茯苓60 g、澤瀉60 g］的處方進(jìn)行水煎，3 個中藥復(fù)方包含的中藥均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗中醫(yī)學(xué)教研室潘志強(qiáng)教授鑒定均為正品。TRIzol（貨號Scipu003462）、PrimeScript? RT reagent Kit（貨號RR047 A）、TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）Ⅱ（貨號RR420 A）購自日本TaKaRa 公司。采用Primer3（v.0.4.0）在線軟件設(shè)計引物，見表1，并委托Life Technologies 公司合成。小鼠皮質(zhì)酮ELISA 試劑盒（貨號501320，批號0521476）購自美國Cayman 公司，促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）ELISA 試劑盒（貨號M046006，批號2518）購自美國MDB 公司；小鼠腎上腺素ELISA 試劑盒（貨號H096，批號20190604）、小鼠去甲腎上腺素ELISA 試劑盒（貨號H097，批號20190604）均購自南京建成生物工程研究所。LDL Receptor 抗體（貨號ab52818）、SR-BI 抗體（貨號ab52629）、StAR 抗體（貨號ab96637）均購自英國Abcam 公司。β-actin 抗體（貨號A5441）購自美國Sigma-Aldrich 公司。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 儀器 小鼠四診設(shè)備包括YLS-13A 型小鼠抓力測定儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）用于抓力檢測，底部有5 cm×5 cm 方格（3 行×5 列=15 格）的實驗籠用于曠場檢測，ThermaCAM P30 型紅外熱像儀器（美國Flir 公司）用于檢測體表紅外溫度。QuantStudioTM3 實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Elx800 型酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司）；5417R 型臺式離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Alpha 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein-Simple 公司）。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，開始實驗。隨機(jī)分為正常對照組、氫化可的松組、四君子湯組、六味地黃湯組、桂附地黃湯組，每組16 只。其中除正常對照組外各組均灌胃給藥1.65 mg/kg氫化可的松進(jìn)行造模；正常對照組灌胃等體積的滅菌水。四君子湯組按12.75 g（生藥）/kg 劑量灌胃給藥四君子湯（0.765 g/mL）；六味地黃湯組按12.5 g（生 藥）/kg 劑量灌 胃給藥 六味地黃湯（0.75 g/mL）；桂附地黃湯組按13.5 g（生藥）/kg劑量灌胃給藥桂附地黃湯（0.81 g/mL）。從第1天同步造模與給藥，持續(xù)14 d；第15 天處死各組半數(shù)小鼠，剩余半數(shù)小鼠停止造模繼續(xù)給予中藥至21 d。

2.2 觀測四診指標(biāo) 分別在實驗第14、21 天，運用本課題組創(chuàng)建的小鼠辨證論治實驗方法學(xué)采集小鼠四診信息，主要包括小鼠一般外觀表現(xiàn)、體質(zhì)量、軀體不同部位紅外溫度、曠場實驗小鼠活動度（在網(wǎng)格中活動60 s 的跨格數(shù)以及前肢離地次數(shù)的總和）、小鼠四肢抓力、腋溫等表征信息，然后進(jìn)行計量化辨證。具體參見文獻(xiàn)［4-6］。

2.3 取材 在實驗第15、22 天，稱定小鼠體質(zhì)量，每組處死8 只小鼠。①取血，分離血清，ELISA 試劑盒檢測皮質(zhì)酮與ACTH 水平；②脾臟、胸腺，稱取臟器質(zhì)量后計算臟器指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）；③取腎上腺組織，抽提總RNA，檢測與Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2 mRNA 表達(dá)；④取腎上腺組織，抽提總蛋白，檢測LDLR、SRBI、StAR 蛋白表達(dá)。

2.4 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 表達(dá) 按照TRIzol 試劑盒說明書抽提腎上腺總RNA；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析，以正常組作為對照，以β-actin 的mRNACt 均值作為內(nèi)參組。ΔCt=Ct目的mRNA-Ct內(nèi)參mRNA（其中，Ct 值為擴(kuò)增n個循環(huán)mRNA 的熒光數(shù)值），ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，目的mRNA 相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。

2.5 ELISA 檢測血清激素水平 用血清樣本，依據(jù)ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素、腎上腺素以及去甲腎上腺素水平。

2.6 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 采用RIPA 裂解液處理組織，收集蛋白質(zhì)樣品并予以定量，通過變性處理，分別執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等實驗流程，其中，一抗?jié)舛葍?nèi)參β-actin 以1∶20 000 稀釋，LDLR 抗體以1∶5 000 稀釋，SRBI、StAR 抗體均以1∶2 000 稀釋。以β-actin 為內(nèi)參對照，分析蛋白相對表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad.Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示。多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠四診指標(biāo)變化

3.1.1 小鼠體質(zhì)量動態(tài)變化（陰盛衰程度）實驗開始時，小鼠體質(zhì)量在28 g 左右。實驗過程中正常對照組小鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長。與正常對照組比較，氫化可的松造模的4 組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)下降。在造模給予中藥同步的14 d 中，氫化可的松造模的4 組小鼠體質(zhì)量均低于正常對照組；在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 中（15 至21 d），氫化可的松組與各中藥組小鼠體質(zhì)量均有所增長，但仍低于正常對照組。見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化（n＝8）Fig.1 Changes of body weight of mice（n＝8）

3.1.2 小鼠曠場活動度以及抓力（氣盛衰程度）在造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠曠場活動度出現(xiàn)降低趨勢；氫化可的松組小鼠抓力低于正常對照組（P＜0.01），見表2。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠抓力仍下降（P＜0.01）；與氫化可的松組比較，各中藥組小鼠曠場活動度均有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而桂附地黃湯組小鼠抓力顯著上升（P＜0.01），見表3。

3.1.3 小鼠不同部位紅外溫度與腋溫（陽盛衰程度）在造模給予中藥同步的14 d 后和在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腋溫未出現(xiàn)變化。在造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松小鼠的頭部最高溫度、軀干平均溫度、尾部最低溫度均有一定的下降趨勢，其中尾部最低溫度下降（P＜0.05）。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松小鼠的頭部最高溫度、軀干平均溫度、尾部最低溫度均有一定的下降趨勢，其中頭部最高溫度下降（P＜0.05）。見表2～3。

表2 中藥復(fù)方對氫化可的松模型小鼠中醫(yī)四診指標(biāo)的影響（14 d，，n＝8）Tab.2 Effects of Chinese herbal compounds on levels of TCM four diagnostic indexes in hydrocortisone model mice（14 d，，n＝8）

表2 中藥復(fù)方對氫化可的松模型小鼠中醫(yī)四診指標(biāo)的影響（14 d，，n＝8）Tab.2 Effects of Chinese herbal compounds on levels of TCM four diagnostic indexes in hydrocortisone model mice（14 d，，n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表3 中藥復(fù)方對氫化可的松模型小鼠中醫(yī)四診指標(biāo)的影響（21 d，，n＝8）Tab.3 Effects of Chinese herbal compounds on levels of TCM four diagnostic indexes in hydrocortisone model mice（21 d，，n＝8）

表3 中藥復(fù)方對氫化可的松模型小鼠中醫(yī)四診指標(biāo)的影響（21 d，，n＝8）Tab.3 Effects of Chinese herbal compounds on levels of TCM four diagnostic indexes in hydrocortisone model mice（21 d，，n＝8）

注：與正常對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與氫化可的松組比較，##P＜0.01。

3.2 小鼠臟器指數(shù)

3.2.1 脾臟指數(shù) 在造模給予中藥同步的14 d后，與正常對照組比較，氫化可的松小鼠脾臟指數(shù)出現(xiàn)下降（P＜0.01）。與氫化可的松組比較，3 個中藥復(fù)方組小鼠脾臟指數(shù)有略微提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d后，氫化可的松組小鼠脾臟指數(shù)仍然低于正常對照組（P＜0.01）；與氫化可的松組比較，六味地黃湯組與桂附地黃湯脾臟指數(shù)有略微提高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

3.2.2 胸腺指數(shù) 在造模給予中藥同步的14 d后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠胸腺指數(shù)下降（P＜0.01）。在停止氫化可的松造模繼續(xù)中藥給予中藥7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠胸腺指數(shù)未出現(xiàn)下降。見圖2。

3.3 腎上腺類固醇激素相關(guān)指標(biāo)

3.3.1 血清皮質(zhì)酮與促腎上腺皮質(zhì)激素水平 造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組血清皮質(zhì)酮下降（P＜0.01）；與氫化可的松組比較，四君子湯組、六味地黃湯組、桂附地黃湯組血清皮質(zhì)酮上升（P＜0.05，P＜0.01）。在停止氫化可的松造模7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組血清皮質(zhì)酮下降（P＜0.01）；與氫化可的松組比較，桂附地黃湯組血清皮質(zhì)酮上升（P＜0.01）。見圖3。

造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組血清促腎上腺皮質(zhì)激素下降（P＜0.05）；與氫化可的松組比較，桂附地黃湯組血清促腎上腺皮質(zhì)激素上升（P＜0.05）。在停止氫化可的松造模7 d 后，各組血清促腎上腺皮質(zhì)激素差異均不明顯。見圖3。

3.3.2 腎上腺類固醇激素合成酶相關(guān)mRNA 表達(dá) 在造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腎上腺類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋 白（STAR）、膽固醇 側(cè)鏈裂解酶（Cyp11a1）、21-羥化酶（Cyp21a1）、11β-羥化酶1（Cyp11b1）、11β-羥化酶2（Cyp11b2）mRNA 下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與氫化可的松組比較，四君子湯組 小鼠腎上腺Star、Cyp11a1、Cyp11b1、Cyp21a1 mRNA 上調(diào)（P＜0.01），六味地黃湯組小鼠腎上腺StarmRNA 上調(diào)（P＜0.05），桂附地黃湯組小鼠腎上腺Star、Cyp21a1、Cyp11b1 mRNA 上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

在停止氫化可的松造模7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腎上腺Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1 mRNA 下 調(diào)（P＜0.01），而Cyp11b2 mRNA 表達(dá)未出現(xiàn)下降，這些mRNA 表達(dá)相對在停止造模前均有所上升；與氫化可的松組比較，四君子湯組小鼠腎上腺Cyp11b2 mRNA 上調(diào)（P＜0.01），六味地黃湯組小鼠腎上腺Cyp11b2 mRNA 上調(diào)（P＜0.05）。與氫化可的松組比較，桂附地黃湯組小鼠腎上腺Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Cyp11b2 mRNA 表達(dá)差異無顯著性。見圖4。

圖2 小鼠脾臟與胸腺指數(shù)（n＝8）Fig.2 Levels of indexes of spleen and thymus in mice（n＝8）

圖3 血清皮質(zhì)酮與促腎上腺皮質(zhì)激素水平（n＝8）Fig.3 Serum levels of corticosterone and ACTH（n＝8）

3.3.3 腎上腺類固醇激素合成相關(guān)蛋白表達(dá) 在造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腎上腺LDLR、SRBI、StAR 蛋白表達(dá)均有所下降，而四君子湯、六味地黃湯、桂附地黃湯3 個中藥復(fù)方對LDLR、SRBI、StAR 蛋白表達(dá)的下降均有改善作用，其中四君子湯促進(jìn)SRBI 和StAR 的表達(dá)最顯著，桂附地黃湯對StAR蛋白有促進(jìn)作用。在停止氫化可的松造模7 d 后，氫化可的松組小鼠腎上腺LDLR、SRBI 以及StAR蛋白表達(dá)有所恢復(fù)。四君子湯、六味地黃湯、桂附地黃湯3 個中藥復(fù)方的小鼠LDLR、SRBI、StAR 蛋白表達(dá)均高于氫化可的松組。見圖5。

3.4 腎上腺素相關(guān)指標(biāo)

3.4.1 血清腎上腺素、去甲腎上腺素水平 造模給予中藥同步的14 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組血清腎上腺素顯著上升（P＜0.05），各組血清去甲腎上腺素差異均不明顯；在停止氫化可的松造模繼續(xù)中藥給予中藥7 d 后，各組血清腎上腺素差異均不明顯，與氫化可的松組比較，桂附地黃湯組血清腎上腺素顯著下降（P＜0.05）。見圖6。

圖4 腎上腺類固醇激素合成酶相關(guān)mRNA 表達(dá)（n＝8）Fig.4 Adrenal steroid hormone synthase-related mRNA expression（n＝8）

圖5 腎上腺類固醇激素合成相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 The protein expressions associated with adrenal steroid hormone synthesis

圖6 血清腎上腺素與去甲腎上腺素水平（n＝8）Fig.6 Serum levels of adrenaline and noradrenaline（n＝8）

3.4.2 腎上腺素合成酶相關(guān)mRNA 表達(dá) 在造模給予中藥同步的14 天后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腎上腺多巴胺β-羥化酶（Dbh）mRNA 上調(diào)（P＜0.05），苯乙胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（Pnmt）mRNA 下調(diào)（P＜0.01）。與氫化可的松組比較，四君子湯組小鼠腎上腺PnmtmRNA 上調(diào)（P＜0.01），六味地黃湯組小鼠腎上腺多巴胺脫羧酶（Ddc）mRNA 上調(diào)（P＜0.05），桂附地黃湯組小鼠腎上腺酪氨酸羥化酶（Th）、Ddc、Dbh和PnmtmRNA 均上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 后，與正常對照組比較，氫化可的松組小鼠腎上腺PnmtmRNA 下調(diào)（P＜0.01）。與氫化可的松組比較，六味地黃湯組小鼠腎上腺Th、Ddc和DbhmRNA 均下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），桂附地黃湯組小鼠腎上腺ThmRNA 上調(diào)（P＜0.01）。見圖7。

圖7 腎上腺素合成酶相關(guān)mRNA 表達(dá)（n＝8）Fig.7 Adrenergic synthase-related mRNA expression（n＝8）

4 討論

4.1 四君子湯、六味地黃湯、桂附地黃湯的功效及其現(xiàn)代研究 四君子湯是基礎(chǔ)性益氣健脾中藥復(fù)方，包括人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草，其主要化學(xué)成分是皂苷、黃酮類、多糖類等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)四君子湯具有調(diào)節(jié)胃腸功能、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等作用。研究表明，四君子煎湯可以通過影響JAK-STAT 信號通路來提高大鼠的免疫機(jī)能［7］；雷波等［8］發(fā)現(xiàn)四君子湯能夠明顯增加自然殺傷細(xì)胞活性和血清轉(zhuǎn)化生長因子-β水平并減少血清干擾素-γ，可以明顯增強(qiáng)CFS 大鼠的免疫力。

六味地黃丸（湯）是經(jīng)典的滋陰補(bǔ)腎中藥復(fù)方，由茯苓、牡丹皮、澤瀉、山藥、山萸肉、熟地黃組成，主要功效是滋陰降火、補(bǔ)益肝腎?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、促皮質(zhì)激素、耐缺氧、疲勞、抗低溫、降低血脂抗動脈硬化等作用。馬健等［9］發(fā)現(xiàn)六味地黃湯增加動物免疫器官的清除自由基能力，避免受到自由基攻擊；馬淵等［10］發(fā)現(xiàn)六味地黃丸對CORT 所致的HPO 軸功能紊亂具有改善作用；蔣寧等［11］發(fā)現(xiàn)六味地黃丸及其各組分可不同程度地調(diào)節(jié)SAMP8 的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)紊亂。

桂附地黃湯（即金匱腎氣丸）是經(jīng)典的補(bǔ)腎中藥復(fù)方，由干地黃、薯蕷、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子組成，主要功效為溫補(bǔ)腎氣、化氣行水?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)桂附地黃湯具有改善下丘腦-垂體-靶腺軸的功能紊亂、抗氧化、衰老、應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫等作用。許翠萍等［12］發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸對腎陽虛模型小鼠體征如自主活動減少、倦怠倦縮、耐寒能力下降等有一定的改善作用，并對促腎上腺皮質(zhì)激素、促皮質(zhì)素釋放激素、皮質(zhì)酮有明顯改善作用，證實金匱腎氣丸可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體腎上腺軸；周智興等［13］發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸組可以明顯提高大鼠胸腺指數(shù)及T、B 淋巴細(xì)胞增殖能力并使干擾素-γ 水平明顯升高。

4.2 3 個中藥復(fù)方對中醫(yī)四診指標(biāo)的影響 根據(jù)本課題組前期研究氫化可的松藥理作用強(qiáng)大，本實驗選擇較低劑量的氫化可的松進(jìn)行造模，中醫(yī)四診方面相關(guān)指標(biāo)如從曠場活動度、腋溫和紅外溫度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是造模后有下降的趨勢。中醫(yī)四診方面評價，體質(zhì)量是中醫(yī)“陰”盛衰程度的重要評價指標(biāo)，體質(zhì)量下降提示了機(jī)體物質(zhì)基礎(chǔ)的減少。在小鼠日飲食量穩(wěn)定的情況下氫化可的松顯著抑制體質(zhì)量的增長造成體質(zhì)量下降，使得機(jī)體出現(xiàn)類似中醫(yī)的陰虛見證。依據(jù)數(shù)據(jù)顯示，氫化可的松造模情況下同步給予3 個中藥復(fù)方，對中醫(yī)陰虛證候均沒有出現(xiàn)顯著的效果。在氫化可的松停止造模后，桂附地黃湯對中醫(yī)陰虛證候有一定程度的效果但不顯著。

小鼠曠場活動度和抓力一定程度反映機(jī)體的“氣”的盛衰程度。依據(jù)數(shù)據(jù)顯示，氫化可的松造成了小鼠一定程度的“氣虛”見證，桂附地黃湯對此有一定的改善，四君子湯和六味地黃湯對氫化可的松引起小鼠“氣虛證”效果不明顯。

體溫可以最直觀的體現(xiàn)機(jī)體的陽熱程度。依據(jù)數(shù)據(jù)顯示，氫化可的松造成了小鼠機(jī)體一定程度的“陽虛”見證。從最高溫度、軀干平均溫度、尾部最低溫度這幾個指標(biāo)看，四君子湯和六味地黃湯對于小鼠的“陽虛”見證療效不顯著，桂附地黃湯在與氫化可的松共同作用是造成小鼠“陽熱”。對氫化可的松造成小鼠的“陽虛證”有一定的改善作用。

4.3 3 個中藥復(fù)方對臟器以及分子指標(biāo)的影響 從臟器變化與相關(guān)分子指標(biāo)變化來看，氫化可的松顯著降低小鼠脾臟指數(shù)，氫化可的松造模與給予中藥復(fù)方同步14 d，3 個中藥復(fù)方均無改善脾臟抑制效應(yīng)。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d后，六味地黃湯和桂附地黃湯對小鼠脾臟均有一定改善。氫化可的松顯著降低小鼠胸腺指數(shù)，氫化可的松造模與給予中藥復(fù)方同步14 d，四君子湯、六味地黃湯和桂附地黃湯對胸腺萎縮有一定改善作用。在停止氫化可的松造模7 d 后，氫化可的松小鼠胸腺基本恢復(fù)。

STAR、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1 和Cyp11b2是腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞膽固醇轉(zhuǎn)化為腎上腺類固醇激素過程中的一些重要酶。從腎上腺類固醇激素相關(guān)基因表達(dá)與血清皮質(zhì)酮、促腎上腺皮質(zhì)激素來看，氫化可的松顯著抑制了腎上腺皮質(zhì)功能。在造模給予中藥同步的14 d 后，四君子湯、六味地黃湯、桂附地黃湯3 個中藥復(fù)方對被抑制的腺皮質(zhì)功能抑制均具有一定糾正作用，其中四君子湯、桂附地黃湯效果較為顯著。在停止氫化可的松造模繼續(xù)給予中藥7 d 后，氫化可的松組小鼠腎上腺皮質(zhì)激素合成酶相關(guān)基因表達(dá)有所有恢復(fù)，3 個中藥復(fù)方效果相對不及造模給予中藥同步時顯著。

低密度脂蛋白受體是一種細(xì)胞表面糖蛋白，主要功能是結(jié)合低密度脂蛋白或其他含載脂蛋白B100 及載脂蛋白E 的脂蛋白，然后內(nèi)吞入細(xì)胞，在膽固醇代謝中起關(guān)鍵作用［14］。而B 族I 型清道夫受體是高密度脂蛋白的受體，能夠介導(dǎo)HDL 膽固醇酯的選擇性吸收［15］。Star 是膽固醇的一種轉(zhuǎn)運蛋白，主要參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝轉(zhuǎn)化為類固醇激素前體物質(zhì)［16］。從以上腎上腺蛋白表達(dá)的變化來看，氫化可的松對于小鼠腎上腺攝取膽固醇以及將膽固醇轉(zhuǎn)化為腎上腺皮質(zhì)激素過程有抑制作用，四君子湯對此過程有促進(jìn)作用且較為明顯，六味地黃湯相對來說效果不顯著。桂附地黃湯對Star蛋白有顯著促進(jìn)，說明可以促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的合成。

酪氨酸被腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞攝取通過Th 轉(zhuǎn)化為多巴，再經(jīng)過Ddc 轉(zhuǎn)化為多巴胺，多巴胺通過Dbh在細(xì)胞核中形成去甲腎上腺素，然后進(jìn)一步經(jīng)的作用，使去甲腎上腺素甲基化形成腎上腺素。氫化可的松對Pnmt 存在一定抑制作用。從腎上腺素合成相關(guān)的mRNA 表達(dá)和血清腎上腺素、去甲腎上腺素的變化綜合分析，氫化可的松對小鼠腎上腺髓質(zhì)功能整體影響不顯著。

綜上所述，從宏觀四診上看，桂附地黃湯對小鼠陽虛證候有所改善；3 個中藥復(fù)方對小鼠陰虛證候療效不顯著。從腎上腺皮質(zhì)功能看，3 個中藥復(fù)方對氫化可的松誘發(fā)的腎上腺皮質(zhì)功能抑制均有緩解作用，其中四君子湯、桂附地黃湯效果相對顯著。