王迎寒，劉玉玲，陳光暉，胡 楠，張曉峰

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以間歇發(fā)作或持續(xù)存在的腹痛或腹部不適，并伴排便習(xí)慣或大便性狀改變?yōu)橹饕R床特點(diǎn)，而又缺乏形態(tài)學(xué)或生化異常等可用器質(zhì)性疾病解釋的功能性腸病。根據(jù)羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)，其病程至少半年，且近3 個(gè)月內(nèi)每周至少1 d 出現(xiàn)相關(guān)癥狀［1］。根據(jù)臨床癥狀可將IBS 分為腹瀉型（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS）、便秘型（constipation-predominant irritable bowel syndrome，C-IBS）、混合型（mixed bowel habits irritable bowel syndrome，M-IBS）、不定型（Unclassified irritable bowel syndrome，U-IBS）［2］，其中以D-IBS 最為多見(jiàn)。近年來(lái)，D-IBS 發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)［3］，但其病理生理學(xué)機(jī)制尚未明確，與腸道動(dòng)力異常、內(nèi)臟敏感性、腸黏膜滲透性的改變及腸道微生物改變、自主神經(jīng)功能障礙、免疫激活、腦-腸軸調(diào)節(jié)功能異常等有關(guān)，為多方面因素共同作用的結(jié)果［4］。就D-IBS 而言，腸運(yùn)動(dòng)增加，腸黏膜通透性增強(qiáng)是腹瀉產(chǎn)生的重要原因；而腸黏膜的滲透性與腸上皮細(xì)胞密切相關(guān)，腸道動(dòng)力與腸平滑肌細(xì)胞密切相關(guān)。健脾化濕顆粒源于臨床，具有理氣健脾、化濕止瀉作用，用于治療D-IBS。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，健脾化濕顆粒能調(diào)節(jié)腸動(dòng)力，減輕腹瀉癥狀，因此，本研究著眼于結(jié)腸上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，擬從上皮細(xì)胞緊密連接蛋白（Occludin，OCLN）、水通道蛋白（aquaporins，AQPs）及平滑肌細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）著手，研究健脾化化濕顆粒止瀉作用的機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 結(jié)腸上皮細(xì)胞株及結(jié)腸平滑肌細(xì)胞株均購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 藥物 健脾化濕顆粒由炙黃芪、益智仁、炒白術(shù)、茯苓、砂仁、烏藥、陳皮、炒白芍、防風(fēng)、炙甘草組成；采用傳統(tǒng)水煎煮法、乙醇洗滌沉淀、減壓濃縮、真空干燥，以干膏粉∶乳糖=1∶1 比例濕法制粒而成；薄層色譜法鑒別防風(fēng)、陳皮、烏藥、炙甘草、白術(shù)五味藥材；高效液相色譜法檢測(cè)炙黃芪和炒白芍的含有量，每克顆粒中炙黃芪不得少于0.15 mg/g（以黃芪甲苷計(jì)），炒白芍不得少于0.75 mg/g（以芍藥苷計(jì)）［5］。健脾化濕顆粒（批號(hào)201610）由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所制備。氯化乙酰膽堿（上海士鋒生物科技有限公司，批號(hào)16091902）；鹽酸阿托品（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1512241）。

1.3 試劑 高糖DMEM（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)8115063）；胎牛血清（德國(guó)Bioclot 公司，批號(hào)1964）；大鼠cAMP 酶聯(lián)免疫試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)Oct 2016）；大鼠AC 酶聯(lián)免疫試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)Oct 2016）；CCK8（500 次）試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)JE603）；兔抗大鼠緊密連接蛋白抗體（Occludin，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AF09265505）；兔抗大鼠水通道蛋白3 抗體（AQP3，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AE042437）；兔抗大鼠水通道蛋白4 抗體（AQP4，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AF09221494）；0.25% 胰酶（含EDTA，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20150423）；山羊抗兔IgGHRP 二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AF11285098S）；兔抗大鼠β-actin 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AF04158601）；BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)P1511）；還原型5×SDS 上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)P0015）；脫脂奶粉（美國(guó)BD 公司，批號(hào)4239539）；化學(xué)發(fā)光試劑A 和B（美國(guó) Thermo Scientific 公司，批號(hào) P1020）；TEMED（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)M146）；30%丙烯酰胺（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)20161021）；過(guò)硫酸銨（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1024D0313）；預(yù)染Marker（美國(guó)Thermo Scientific公司，批號(hào)00389282）；PVDF 膜（美國(guó)Millipore公司，0.45 μm）。

1.4 儀器 YT-875SB 型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠）；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；HZQ-X100 恒溫震蕩培養(yǎng)箱（江蘇同君儀器科技有限公司）；BH-2 型顯微鏡及攝像裝置（日本Olympus 公司）；Multiskan MK 3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Labsystems 公司）；LD4-2A 低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；Velocity18 r 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（瑞士Dynamica公司）；WD-9405B 水平搖床、DYY-7C 轉(zhuǎn)印電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；CP214 電子分析天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］；DYCZ-40D 迷你轉(zhuǎn)印電泳儀、DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀（北京市六一儀器廠）；Tanon 6100 電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 收到細(xì)胞株后，鏡下觀察，上皮細(xì)胞呈不規(guī)則卵圓形，平滑肌細(xì)胞呈梭形，均已長(zhǎng)滿90%瓶底。常規(guī)方法按1∶3 比例進(jìn)行傳代擴(kuò)增，調(diào)細(xì)胞濃度至5×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、95% O2和5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后換液，以后每3 d 更換培養(yǎng)基1 次，期間用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞長(zhǎng)滿90%培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代，部分凍存，將第8 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 健脾化濕顆粒溶液配制 精確稱定200 mg 健脾化濕顆粒粉（未加輔料），加入2 mL PBS 緩沖液，充分溶解，無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，質(zhì)量濃度為100 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。用時(shí)按比例稀釋。

2.3 檢測(cè)健脾化濕顆粒處理后上皮細(xì)胞存活率 采用CCK-8 法。收集長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%融合度的第7代結(jié)腸上皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的健脾化濕顆粒溶液，使健脾化濕顆粒的質(zhì)量濃度為1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)復(fù)孔，孵育24、48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)孵 育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)吸光度值 ［OD（45 nm）］。重復(fù)3次，選擇適宜的健脾化濕顆粒濃度。

2.4 檢測(cè)健脾化濕顆粒處理后上皮細(xì)胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達(dá) 采用Western blot 法。收集長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%融合度的第7 代結(jié)腸上皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種到6 孔板中，每孔3 mL，培 養(yǎng)24 h 后，加入健 脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后，棄去培養(yǎng)液，PBS 緩沖液洗3 次，棄去，將培養(yǎng)板倒扣在吸水紙上吸干液體，每孔加入200 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min，經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)使細(xì)胞充分裂解。裂解完后，用干凈的刮棒迅速將細(xì)胞刮下，然后將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL 離心管中。4 ℃，12 000 r/min 離心5 min。將離心后的上清分裝0.5 mL 的離心管中，每管50 μL，-20 ℃保存，重復(fù)3 次。用BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)各樣本蛋白濃度，各樣本取50 μg蛋白量上樣（5%濃縮膠，12.5%分離膠），電泳至溴酚蘭剛跑出邊緣終止（濃縮膠80 V，分離膠120 V）。400 mA 恒流轉(zhuǎn)膜3 h，一抗（OCLN 抗體1∶200，AQP3 抗體1∶200，AQP4 抗體1∶1 000；β-actin 抗體1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下二抗（1∶2 000）孵育2 h，滴加電化學(xué)發(fā)光液，1 min后用Tanon 6100 電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光拍照，曝光時(shí)間10 s。圖片用WD-94BA 凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行半定量分析，測(cè)定目的條帶光密度值。各目的蛋白的光密度與β-actin 條帶光密度的比值乘以100%作為該蛋白表達(dá)水平參數(shù)。

2.5 檢測(cè)健脾化濕顆粒處理后結(jié)腸平滑肌細(xì)胞舒縮 收集長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%融合度的第7 代結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×104/mL，接種到96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h 后，加入健脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照，孵育24 h 后，用胰酶消化，收集各孔細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使終濃度Ach 為1×10-8mmol/mL，阿托品為60 μmol/L，孵育30 s，最后加入30 μL 2.5%戊二醛終止反應(yīng)，各組分別取20 μL 細(xì)胞懸液滴于載波片上，作為一個(gè)檢體，于倒置顯微鏡下觀察，每個(gè)檢體隨機(jī)測(cè)量邊續(xù)視野下30 個(gè)完整細(xì)胞的長(zhǎng)度，計(jì)算細(xì)胞平均長(zhǎng)度，重復(fù)3 次。

2.6 檢測(cè)健脾化濕顆粒處理后結(jié)腸平滑肌細(xì)胞cAMP、AC 的水平 收集長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80% 融合度的第7 代結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種到24 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后，加入健脾化濕顆粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照，孵育24 h后，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使終濃度 Ach 為 1×10-8mmol/mL，阿托品 為60 μmol/L，孵育30 s，快速棄去培養(yǎng)上清，PBS緩沖液 洗3 次，然后每孔加入 PBS 緩沖液400 μL，反復(fù)凍融3 次，-80 ℃保存，重復(fù)3 次。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒要求檢測(cè)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAM、AC 水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。若方差齊則采用LSD 檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞存活率的影響 健脾化濕顆粒質(zhì)量濃度≤1 mg/mL時(shí)，結(jié)腸上皮細(xì)胞存活率≥90%，且24 h、48 h 趨勢(shì)相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。確定健脾化濕顆粒質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.25 mg/mL，孵育時(shí)間為24 h，做后續(xù)研究。見(jiàn)圖1。

3.2 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）上皮細(xì)胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1、圖2。

表1 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達(dá)的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

表1 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達(dá)的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖2 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells

3.3 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞舒縮的影響 健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能增加結(jié)腸平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度（P＜0.05，P＜0.01）；加入Ach 干預(yù)后，結(jié)腸平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度減?。≒＜0.01），而健脾化濕顆粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能顯著抑制Ach 引起的平滑肌細(xì)胞收縮（P＜0.05，P＜0.01）；加入阿托品干預(yù)后，結(jié)腸平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度增加，健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）與阿托品協(xié)同作用促進(jìn)平滑肌細(xì)胞舒張（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

3.4 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞cAMP、AC的影響 與正常組比較，健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）可降低結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP、AC 的水平（P＜0.05，P＜0.01）；Ach 升高結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP、AC 的水平（P＜0.01）；健脾化濕顆粒（1、0.5 mg/mL）能抑制Ach 引起的平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP、AC 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與阿托品有協(xié)同作用降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP、AC水平（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表2 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度的影響（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

表2 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)度的影響（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

注：與正常組比較，# P ＜0.05，##P ＜0.01；與Ach 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與阿托品組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表4 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞cAMP、AC 的影響（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

表4 健脾化濕顆粒對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞cAMP、AC 的影響（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與Ach 組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與阿托品組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

IBS 是臨床上常見(jiàn)的功能性消化道疾病，以D-IBS較為多見(jiàn)，好發(fā)于青壯年，具有發(fā)病率高和反復(fù)發(fā)作的特征，給患者的工作和生活帶來(lái)不便，且消耗大量的醫(yī)療資源。D-IBS 的病理生理學(xué)機(jī)制尚未明確，D-IBS 的發(fā)生與腸道動(dòng)力異常、內(nèi)臟敏感性異常、腦腸軸功能異常等因素密切相關(guān)，并通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多方面的綜合作用導(dǎo)致腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)障礙和水液代謝功能紊亂［6］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，水液的吸收部位主要在腸道，消化道內(nèi)大部分水分被小腸吸收，不能被小腸吸收的水液進(jìn)入結(jié)腸。如果進(jìn)入結(jié)腸的水液超過(guò)了其吸收能力或者結(jié)腸吸收水液的能力下降，都會(huì)導(dǎo)致糞便中的水液增加，發(fā)生腹瀉［7］。因此，AQPs表達(dá)減少，不能有效的轉(zhuǎn)運(yùn)水液；腸運(yùn)動(dòng)加快，使結(jié)腸不能充分吸收水液，均可以導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。

AQPs 又名水孔蛋白，廣泛分布于機(jī)體中，目前在消化道已發(fā)現(xiàn)有9 種AQPs 表達(dá)。它們分布于腸黏膜中，主要介導(dǎo)水液的跨膜轉(zhuǎn)動(dòng)，以便維持腸道細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，AQP3 可通過(guò)介導(dǎo)腸腔與血管之間的水液轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)結(jié)腸中的糞便含水量，其作用可被HgCl2或CuSO4抑制［8］；血管活性腸多肽可通過(guò)cAMP-PKA 依賴性途徑上調(diào)AQP3 的表達(dá)，從而改變腸黏膜對(duì)水的通透性，調(diào)節(jié)水的跨膜運(yùn)動(dòng)，影響胃腸道分泌、吸收功能［9］。AQP4 主要位于結(jié)腸上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜，同樣參與了跨細(xì)胞水液轉(zhuǎn)動(dòng)，在cAMP-PKA 信號(hào)通路介導(dǎo)下，AQP4 異常表達(dá)在D-IBS 的病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用［10］。

一直以來(lái)，胃腸動(dòng)力異常作為IBS 的主要病理生理之一。胃腸運(yùn)動(dòng)依賴于胃腸道平滑肌的收縮和舒張，并受腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)控。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的研究已經(jīng)從宏觀的在體和離體腸管實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞層面，甚至是某個(gè)信號(hào)通路的研究。平滑肌細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)的基本單位，其上分布著各種類型的受體，如激動(dòng)型受體中的M 受體、5-HT 受體等，激活此類受體，可引起細(xì)胞的收縮，使腸道運(yùn)動(dòng)加快。

cAMP 被稱為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，在G 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路中起重要的調(diào)控作用，參與人體的各種活動(dòng)。在胃腸道，cAMP 調(diào)控作用涉及黏膜層、肌層以及腸神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)胃腸道的運(yùn)動(dòng)功能、內(nèi)臟感覺(jué)及分泌功能都具有非常重要的調(diào)節(jié)作用［11］。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，首先激活Gs 蛋白，再激活A(yù)C，從而產(chǎn)生cAMP，生成的cAMP 可進(jìn)一步激活蛋白激酶A，進(jìn)而影響多種蛋白的磷酸化及離子通道的激活或失活，使細(xì)胞對(duì)外界刺激產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。在結(jié)腸平滑肌中，可由M 受體活化而增加。

健脾化濕顆粒配方來(lái)源于臨床，該方具有理氣健脾、祛濕止瀉之效，主要用來(lái)治療D-IBS，療效確切。本課題組前期研究［12-18］結(jié)果顯示，健脾化濕顆?？梢越档虳-IBS 大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)及內(nèi)臟敏感性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腦腸軸功能，改善腦腸肽的水平及其受體的表達(dá)有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用CCK-8 試劑盒檢測(cè)不同濃度健脾化濕顆粒對(duì)上皮細(xì)胞存活率的影響，確定1、0.5、0.25 mg/mL 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度，孵育時(shí)間為24 h；3 個(gè)濃度的健脾化濕顆?？娠@著升高上皮細(xì)胞OCLN、AQP3、AQP4 表達(dá)；均可顯著增加結(jié)腸平滑肌的長(zhǎng)度，顯著抑制Ach 引起的平滑肌細(xì)胞收縮及協(xié)同阿托品促進(jìn)平滑肌細(xì)胞舒張（P＜0.05，P＜0.01）；1、0.5 mg/mL 健脾化濕顆?？娠@著降低平滑肌細(xì)胞內(nèi)AC、cAMP 的水平，抑制由Ach 引起的平滑肌細(xì)胞內(nèi)AC、cAMP 水平的升高及協(xié)同阿托品引起平滑肌細(xì)胞內(nèi)AC、cAMP 水平的降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示健脾化濕顆?？赏ㄟ^(guò)增加上皮細(xì)胞OCLN、AQP3、AQP4 表達(dá)增強(qiáng)腸道對(duì)水液的主動(dòng)吸收；亦可通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞內(nèi)AC、cAMP 的水平，從而改善平滑肌運(yùn)動(dòng)功能，此過(guò)程中有M受體的參與。結(jié)合前期研究結(jié)果，課題組分析健脾化濕顆粒的作用機(jī)制并不單一，對(duì)上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的作用也不止于此，因此，在后續(xù)研究工作中，課題組還需要進(jìn)一步擴(kuò)展思路，深度挖掘健脾化濕顆粒治療D-IBS 的作用機(jī)制。