米雅慧，郭思宇，劉明平，韋品清，程 歡，柯國韓

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

偏頭痛是一種搏動性中度或重度原發(fā)性頭痛，通常單側(cè)發(fā)生［1］，影響至少15%的一般人群［2］，中醫(yī)藥治療該疾病時表現(xiàn)出良好的療效。天麻丸收載于《御藥院方》，由川芎、天麻2 味藥材組成，主治首風(fēng)旋暈弦急、偏正頭疼、外合陽氣、風(fēng)寒相搏、胃膈痰飲、身體拘倦［3］，方中川芎及其主要化合物具有增加冠狀動脈血流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集、鎮(zhèn)靜、神經(jīng)保護(hù)等作用［4-5］，而天麻功效鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗氧化等［6］。川芎嗪、阿魏酸是前者代表性活性成分，而天麻素、天麻苷元是后者主要有效成分，兩者配伍是治療偏頭痛的常用藥對［7］。課題組前期進(jìn)行了川芎-天麻不同配比對血瘀型偏頭痛大鼠的藥效學(xué)分析及體內(nèi)藥動學(xué)研究，本實驗在此基礎(chǔ)上，探討其對川芎中川芎嗪、阿魏酸在血瘀偏頭痛大鼠腦內(nèi)藥動學(xué)影響，以期揭示古方配伍的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

微透析系統(tǒng)，配置MD-1001 推進(jìn)器、MD-1000單注射泵控制器、MDN-0100 氣密性注射器（1 mL）、MF-5164 連接管、MD-1002 三注射器支架、MD-2310 脈管探針、MD-1510 接頭（美國BASI 公司）；Surveyor 超高效液相色譜儀，配置Xcalibur 2.0 工作站、TSQ QUANTUM AC-CESS 三級四極桿質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；XR205SM-DR 型分析天平（瑞士Precisa 公司）。

鹽酸川芎嗪、阿魏酸（批號110817-201006、110773-201313）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；川芎嗪、阿魏酸（批號150615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)88%、85%）及天麻苷元、天麻素（批號150515，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86%、89%）對照品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純，分別購自美國CNW 公司、德國Merck 公司；甲酸為分析純，購自美國Sigma 公司。SPF 級雄性SD 大鼠18 只，體質(zhì)量（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0020。

2 方法

2.1 對照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取對照品川芎嗪3 mg、阿魏酸2 mg，分別加入格林氏液、人工腦脊液，定容至100 mL，作為母液，再分別精密稱取兩者3、2 mg，置于100 mL 量瓶中，超純水定容至刻度，得對照品溶液。精密吸取新諾明1 mL，加入林格氏液和人工腦脊液，定容至100 mL，得內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 川芎嗪、阿魏酸含有量測定

2.2.1 質(zhì)譜條件 噴霧電壓，正離子模式4 500 V，負(fù)離子模式-4 500 V；大氣壓電噴霧離子源，溫度450 ℃；正離子檢測電壓46 eV，負(fù)離子檢測電壓32 eV；川芎嗪正離子模式檢測，m/z137.1～80.05；阿魏酸負(fù) 離子模 式檢測，m/z193.1～134.2。質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 各成分二級質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrograms of various constituents

2.2.2 色譜條件 Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相乙腈（A）-0.005% 甲酸（B），梯度洗脫（0～5 min，20% A，80% B；5～10 min，20%～90% A，80%～10% B；5.1～10 min，20%A，80% B）；體積流量0.3 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2 μL；托盤溫度4 ℃。

2.2.3 專屬性考察 將空白透析液、對照品溶液、給藥后平衡0.5 h 透析液在“2.2.1”和“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。由此可知，空白透析液基線平穩(wěn)，對照品溶液、透析液中阿魏酸峰形良好，與內(nèi)標(biāo)互不干擾；腦組織透析液中川芎嗪、阿魏酸保留時間分別為1.67、2.03 min，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品鹽酸川芎嗪6.06 mg（相當(dāng)于川芎嗪5.08 mg）、阿魏酸4.11 mg，人工腦脊液定容于100 mL 量瓶中，將其倍比稀釋后得到阿魏酸質(zhì)量濃度分別為1 052.16、526.08、263.04、131.52、65.76、32.88、16.44、8.22、4.11、2.05 ng/mL，川芎嗪 質(zhì)量濃 度分別 為1 300.48、650.24、325.12、162.56、81.28、40.64、20.32、10.16、5.08、2.54 ng/mL，作為對照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程分別為川芎嗪Y=0.005 957X+0.038 16（R2=0.998 9），線性范圍3.21～1 444.5 ng/mL；阿魏酸Y=0.004 25X+0.021 86（R2=0.999 5），線性范圍5.47～2 461.5 ng/mL。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 配制低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定6 次，測得川芎嗪日間精密度RSD 分別為1.93%、2.65%、2.94%，日內(nèi)精密度RSD 分別為3.67%、2.17%、3.06%；阿魏酸前者RSD 分別為2.94%、3.42%、1.73%，后者RSD 分別為3.69%、2.81%、3.14%，表明該方法精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 配置低、中、高質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.2.1”和“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定6 次，測得川芎嗪峰面積RSD 分別為4.32%、2.08%、2.75%，阿魏酸分別為2.78%、4.01%、3.62%。另外，樣品在25 ℃（室溫）、-80 ℃下保存30 d 及-80～25 ℃循環(huán)凍融條件下，川芎嗪峰面積RSD 分別為4.97%、2.54%、2.13%；3.06%、2.45%、2.67%；2.33%、2.21%、2.34%，而阿魏酸分別為2.12%、3.32%、2.64%；2.82%、3.49%、2.45%；2.55%、2.41%、1.98%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 分別取川芎嗪（5.08 ng/mL）、阿魏 酸（4.11 ng/mL）對照品溶液 100、40、10 μL，加到空白人工腦脊液中，使其總體積為200 μL，在“2.2.1”和“2.2.2”項條件下進(jìn)樣測定，測得川芎嗪平均加樣回收率分別為98.82%、101.64%、99.15%，RSD 分別為2.42%、3.12%、2.98%；阿魏酸平均加樣回收率分別為101.21%、99.32%、100.52%，RSD 分別為2.42%、2.56%、3.31%。

2.2.8 體積流量對相對損失率的影響 空白、含藥人工腦脊液及林格氏液在25 ℃下以不同體積流量灌流，探針置于其中，平衡后各收集6 份樣品，UPLC-MS/MS 法測定接收樣品質(zhì)量濃度C透析和含藥人工腦脊液中藥物質(zhì)量濃度C灌流，計算相對損失率，公式為相對損失率=［（C灌流-C透析）/C灌流］×100%。結(jié)果，人工腦脊液中川芎嗪、阿魏酸相對損失率 分別為 40.11%、36.50%、30.73%、28.99%、27.07%；39.58%、36.00%、33.19%、32.02%、29.52%，而林格氏液中兩者相對損失率分別為41.02%、37.37%、32.85%、28.44%、24.91%；40.02%、37.57%、33.93%、30.28%、28.41%。

2.2.9 質(zhì)量濃度對相對損失率的影響 將探針分別置于川芎嗪/阿魏酸質(zhì)量濃度30/80、140/300、460/800、1 000/1 800 ng/mL 的含藥、空白人工腦脊液和林格氏液中，25 ℃下以1.5 μL/min 體積流量灌流探針，平衡后各收集6 份樣品，按“2.2.8”項下方法計算相對損失率。結(jié)果，人工腦脊液中川芎嗪和阿魏酸相對損失率分別為 36.54%、41.90%、37.92%、40.38% 和38.63%、36.73%、38.92%、34.50%，而林格氏液中兩者相對損失率分別 為37.74%、38.42%、40.86%、42.27% 和41.06%、39.42%、38.93%、32.19%。

2.2.10 溫度對相對損失率的影響 腦探針分別置于25、30、35、40 ℃下，將140、460 ng/mL 川芎嗪、阿魏酸含藥、空白人工腦脊液和林格氏液以1.5 μL/min 體積流量灌流探針，平衡后各收集6份樣品，按“2.2.8”項下方法計算相對損失率。結(jié)果，在不同溫度下，人工腦脊液中川芎嗪和阿魏酸相對損失率分別為33.91%、33.46%、35.77%、39.28% 和32.31%、34.68%、36.85%、40.08%，而林格氏液中兩者相對損失率分別為31.30%、36.20%、37.76%、41.58% 和27.31%、34.68%、36.85%、40.08%。

2.3 藥動學(xué)研究

2.3.1 模型制備 大鼠隨機(jī)分為川芎組、川芎-天麻（1∶0.25）組、川芎-天麻（1∶1）組，皮下注射0.8 mL/kg 鹽酸腎上腺素，2 h 后置于0 ℃冰水中冷刺激5 min，2 h 后再注射鹽酸腎上腺素，復(fù)制血瘀型偏頭痛大鼠模型，然后禁食不禁水；另取大鼠，皮下注射硝酸甘油以復(fù)制偏頭痛模型。

2.3.2 模型評估 大鼠從冰水中取出后，其表現(xiàn)為蜷縮少動，爪、尾部出現(xiàn)紫暗淤血，耳色暗紅，喜扎堆、靜處，呼吸減弱，被毛無光澤，畏寒喜暖等。激光多普勒血流儀檢測發(fā)現(xiàn)其灌注量較正常大鼠顯著降低，見圖3；大鼠注射硝酸甘油后30 min，出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、焦躁不安、爬籠次數(shù)增多的癥狀，表明模型復(fù)制成功［8］。

圖3 激光多普勒血流儀檢測大鼠結(jié)果Fig.3 Results of laser Doppler flowmeter detection of rats

2.3.3 探針植入 大鼠腹腔注射 20%（0.8 mL/100 g）烏拉坦麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀中，剔除頭部被毛，分離大鼠頭皮和腦外膜，暴露頭骨，將腦探針固定于坐標(biāo)AP+0.2 mm、MR +3.5 mm（人字交叉點(diǎn)為坐標(biāo)中心）處，植入腦組織探針后，空白人工腦脊液以1.5 μL/min 體積流量灌流平衡［9-10］。

2.3.4 給藥 將“2.3.1”項下各組大鼠分別灌胃給予川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg；川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg、天麻素183 mg/kg+天麻苷元24 mg/kg；川芎嗪5.25 mg/kg、阿魏酸63.75 mg/kg、天麻素45.75 mg/kg +天麻苷 元6 mg/kg，2 min 后開始接收樣品以排除空白人工腦脊液的干擾。在預(yù)定時間點(diǎn)（川芎嗪5、10、20、40、60、…、480 min，阿魏酸5、10、20、40、…、240 min）接受透析液，-70 ℃冰箱中保存，UPLC-MS/MS 法測定川芎嗪、阿魏酸含有量。

2.3.5 數(shù)據(jù)分析 按公式相對損失率=［（C灌注-C透析）/C灌注］×100% 校正體內(nèi)回收率，體內(nèi)有效成分實際質(zhì)量濃度（C實際）=測定值（C測）/相對損失率。通過PKSolver 軟件［11］計算主要藥動學(xué)參數(shù)，SPSS 23.0 軟件［12］對其進(jìn)行LSD 檢驗。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪血藥濃度-時間曲線、藥動學(xué)研究 圖4、表1 顯示，與單味藥組比較，配伍組T1/2、MRT0～∞、Cmax、AUC0～∞升 高（P＜0.05，P＜0.01）；與川芎-天麻（1∶1）組比較，川芎-天麻（1∶0.25）組T1/2、MRT0～∞、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），Cmax降低（P＜0.05）。

3.2 阿魏酸血藥濃度-時間曲線、藥動學(xué)研究 圖4、表2 顯示，與單味藥組比較，配伍組T1/2［川芎-天麻（1∶1）組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）］、MRT0～∞、Cmax、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01）；與川芎-天麻（1∶1）組比較，川芎-天麻（1∶0.25）組T1/2、MRT0～∞、AUC0～∞升高（P＜0.01）。

4 討論

川芎、天麻效應(yīng)成分川芎嗪、阿魏酸在腦組織中的藥動擬合情況根據(jù)擬合優(yōu)度R2、AIC 等指標(biāo)確定最佳房室模型，發(fā)現(xiàn)兩者在血液、腦組織中均符合一室模型。根據(jù)擬合結(jié)果的藥動學(xué)參數(shù)可知，配伍天麻后川芎嗪、阿魏酸Tmax延長，Cmax升高，MRT 減慢，AUC0～∞延長，吸收程度增加；與川芎-天麻（1∶1）組比較，川芎-天麻（1∶0.25）組MRT 進(jìn)一步減慢，AUC0～∞進(jìn)一步延長，表明天麻可促進(jìn)兩者透過血腦屏障、到達(dá)腦組織來發(fā)揮治療偏頭痛的作用，其原因可能為它可使血腦屏障通透性降低，增加兩者腦內(nèi)生物利用度和滯留時間，并延緩了腦內(nèi)消除速率。

圖4 大鼠血漿中各成分血藥濃度-時間曲線Fig.4 Blood concentration-time curves for various constituents in rat plasma

表1 大鼠血漿中川芎嗪主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for tetramethylpyrazine in rat plasma（）

表1 大鼠血漿中川芎嗪主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for tetramethylpyrazine in rat plasma（）

注：與川芎單味藥比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與川芎-天麻（1∶1）比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表2 大鼠血漿中阿魏酸主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for ferulic acid in rat plasma（）

表2 大鼠血漿中阿魏酸主要藥動學(xué)參數(shù)（）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for ferulic acid in rat plasma（）

注：與川芎單味藥比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與川芎-天麻（1∶1）比較，△△P＜0.01。

同時還發(fā)現(xiàn)，川芎-天麻比例1∶0.25 時生物利用度最大，而1∶1 時腦組織Cmax最高，這可能與天麻素可提高血流速度變化指數(shù)［13］、加快川芎效應(yīng)成分透過血腦屏障速度、增加腦組織中川芎嗪和阿魏酸蓄積量有關(guān)。