史紫蘭

柑橘屬于國(guó)內(nèi)第一大類(lèi)水果品種，它的銷(xiāo)量大且種植面積廣。近年來(lái)，隨著柑橘種植規(guī)模的持續(xù)擴(kuò)大的同時(shí)，也帶來(lái)了嚴(yán)重的病蟲(chóng)害困擾，其中隱患較大的當(dāng)屬柑橘黃龍病。柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)中一直無(wú)法根治的大難題，給世界柑橘產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了毀滅性危害。故此，也被稱(chēng)為“柑橘癌癥”，可侵染各種柑橘類(lèi)及其近緣屬作物。柳州市地處亞熱帶，有著豐富的柑橘品種和柑橘果園。本文實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于廣西柳州市柑橘果園，選擇了廣西柳州市砂糖橘、溫州柑、南豐蜜桔、甜橙等四種感病柑橘品種進(jìn)行黃龍病葉片的采集、處理。本試驗(yàn)應(yīng)用了CTAB法進(jìn)行柑橘葉片的DNA提取以及熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)葉片感病情況進(jìn)行檢測(cè)。

一、柑橘黃龍病的田間調(diào)查

自2018年12月起，根據(jù)黃龍病的發(fā)病規(guī)律對(duì)柳州市柑橘果園的砂糖橘、溫州柑、南豐蜜桔、甜橙、沃柑、桔柚等主要品種出現(xiàn)的黃龍病疑似癥狀進(jìn)行全面調(diào)查和分析，病害癥狀主要表現(xiàn)為葉片黃化、斑駁，出現(xiàn)“紅鼻子果”，以及果實(shí)口感酸澀等。根據(jù)病樹(shù)表現(xiàn)出的葉片、果實(shí)、枝干的表型特征，在田間進(jìn)行初步診斷。根據(jù)黃龍病病菌主要集中在葉片中脈的特點(diǎn)，我們對(duì)樹(shù)齡相近、生長(zhǎng)時(shí)期相近的柑橘病葉進(jìn)行了采集。采摘有斑駁狀或類(lèi)似黃龍病癥狀的枝葉，放入采樣袋中密封，用水洗凈灰塵拍照整理，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

二、CTAB法提取柑橘黃龍病葉片DNA

手術(shù)剪用酒精燈消毒后分別取其主葉脈約100mg，加入液氮充分研磨至粉末狀，將粉末用EP管裝好置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。自行配制CTAB提取液。從柳州果園共采南豐蜜桔、甜橙、溫州柑、砂糖橘四個(gè)品種共50株，用CTAB法提取50個(gè)樣本的DNA并用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度確保DNA濃度適宜做QPCR鑒定。

三、對(duì)黃龍病疑似癥狀采樣進(jìn)行QPCR分子檢測(cè)確診

以篩選出的感病植株GG14作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)50個(gè)DNA樣品進(jìn)行QPCR鑒定。定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度等級(jí)非常高，在確保柑橘樣品DNA的純度和濃度的情況下，對(duì)比常規(guī)PCR靈敏度低的特點(diǎn)，可以?xún)?yōu)先考慮使用定量PCR。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)來(lái)自柳州柑橘果園的顯癥葉片進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與田間診斷結(jié)果情況一致，表明本熒光定量PCR檢測(cè)方法可作為柑橘黃龍病早期診斷的靈敏、可靠、快速的檢測(cè)手段。QPCR結(jié)果如下：

四、基于GC-MS的柑橘葉片代謝物鑒定

取柑橘整葉片加液氮研磨成粉末，精確稱(chēng)量50mg柑橘葉片樣品;放入2mL的離心管中;加入500？l提取液（甲醇：水=4：1）于樣品中;加入一顆鋼珠，低溫下高通量組織破碎儀破碎（50Hz，3min）;加入200uL氯仿，低溫下，高通量組織破碎儀破碎;（50Hz，3min）;渦旋混勻后，冰水浴超聲萃取30min;將樣品靜置于-20℃，30min;離心20min（12000rcf，4℃），取上清液裝入玻璃衍生瓶中，真空抽干;向玻璃衍生小瓶中加入80？L的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（15mg/mL），渦旋震蕩2min后，于震蕩培養(yǎng)箱中37°C中90min進(jìn)行肟化反應(yīng);將樣本取出后再加入80？LBSTFA（含1%TMCS）衍生試劑和20？L的正己烷，渦旋震蕩2min后，于70℃反應(yīng)60min;取出樣本后，在室溫放置30min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。

50組柑橘樣品代謝物定性結(jié)果如表2所示：

五、柑橘黃龍病的防治對(duì)策

到目前為止，黃龍病致病菌在離體條件下依然難以培養(yǎng)，基因改良育種的方式不能大規(guī)模普及應(yīng)用，有待學(xué)者們更進(jìn)一步的研究;對(duì)柑橘苗木脫毒處理能夠使病情有效延緩，但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，柑橘苗木自身抵抗感染的能力并沒(méi)有增強(qiáng)。所以從源頭上不是能真正抑制病菌的方法;生物防治需要投入大量的時(shí)間、人力、物力，成本很高且見(jiàn)效時(shí)間長(zhǎng)，也不宜廣泛采用;化學(xué)防治雖然見(jiàn)效快、能有效殺死黃龍病的傳播媒介—木虱，但同時(shí)也危害了自然環(huán)境，建議在柑橘園有效使用防蟲(chóng)網(wǎng)，可以阻止病害蟲(chóng)傳播。雖然簡(jiǎn)單、有效地隔離柑橘木虱等傳播媒介病害蟲(chóng)，從而抑制黃龍病的發(fā)生。也可以利用昆蟲(chóng)的趨性，設(shè)置誘捕器等殺死黃龍病的傳播媒介害蟲(chóng)。

（作者單位：530004 廣西大學(xué)）