王曉飛 丁明

摘? 要：蛋白質(zhì)通過(guò)形成復(fù)合物或蛋白-蛋白相互作用來(lái)執(zhí)行生物學(xué)功能，蛋白-蛋白相互作用是細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，也是整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域研究的核心問(wèn)題之一。傳統(tǒng)的互作蛋白篩選方法包括酵母雙雜交和串聯(lián)親和純化等，但這些方法具有一定的局限性，很難適用于實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)蛋白相互作用分析。鄰近依賴(lài)生物素鑒定（BioID，proximity-dependent biotin identification）是篩選活細(xì)胞中發(fā)生的蛋白相互作用的獨(dú)特方法，利用修飾過(guò)的生物素連接酶BirA與感興趣的蛋白融合表達(dá)，生物素化近端內(nèi)源蛋白質(zhì)，生物素化的蛋白可以被選擇性分離并用生物質(zhì)譜鑒定出目標(biāo)蛋白的候選相互作用物。BioID已成功應(yīng)用于不溶性蛋白及瞬時(shí)或弱相互作用蛋白的研究，也逐漸應(yīng)用于腫瘤等疾病發(fā)生機(jī)制及藥物靶點(diǎn)篩選的研究。文章針對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)，并討論了其在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：BioID;鄰近蛋白標(biāo)記;蛋白-蛋白相互作用

Abstract： Proteins perform biological functions by forming complexes or protein-protein interactions. Protein-protein interaction is not only the basis of cell life activities， but also one of the core issues in the whole biological field. Traditional protein screening methods include yeast two-hybrid and tandem affinity purification， but these methods have some limitations and are difficult to be applied to real-time and dynamic protein interaction analysis. Proximity-dependent biotin identification （BioID） is a unique method for screening protein interactions in living cells. Using the fusion expression of modified biotin ligase BirA with proteins of interest， biotinylated proximal endogenous proteins and biotinylated proteins can be selectively isolated and candidate interactions of target proteins can be identified by mass spectrometry. BioID has been successfully applied to the study of insoluble proteins and transient or weakly interacting proteins， and also gradually applied to the pathogenesis of tumors and other diseases as well as drug target screening. In this paper， this technique is summarized in detail， and its application in tumor proteomics is discussed.

前言

在生命體中，蛋白質(zhì)是發(fā)揮作用的主體。細(xì)胞中各種復(fù)雜的生理活動(dòng)以及細(xì)胞對(duì)外部環(huán)境的反應(yīng)均基于蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而形成復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)相互作用（PPI）包括形成比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物或瞬時(shí)相互作用，一些蛋白質(zhì)之間的瞬時(shí)相互作用往往具有重要的生理功能。PPI大多是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程，會(huì)隨著時(shí)間、細(xì)胞周期進(jìn)程或組織類(lèi)型而改變，并且可能受到如翻譯后修飾，蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化等許多因素的影響，具有瞬時(shí)性、弱相互作用和受多因素調(diào)節(jié)等特點(diǎn)[1]。目前已開(kāi)發(fā)了許多方法以研究PPI，例如酵母雙雜交和串聯(lián)親和純化等[2，3]。對(duì)于穩(wěn)定的PPI，依賴(lài)于親和純化的生物化學(xué)方法可靠并被廣泛使用，串聯(lián)親和純化使用兩個(gè)標(biāo)簽經(jīng)過(guò)兩步連續(xù)的親和純化，提高了純化產(chǎn)物的特異性，但缺點(diǎn)是有些瞬時(shí)性及弱相互作用難以檢測(cè)到[3]?；赑PI親和力，還開(kāi)發(fā)了一些高通量篩選方法，最廣泛使用的酵母雙雜交系統(tǒng)可用于鑒定給定靶蛋白的候選相互作用配體。這種基于酵母的方法也已經(jīng)升級(jí)以適應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，然而酵母雙雜交系統(tǒng)也存在著高假陽(yáng)性率和陰性結(jié)果[2]。

通過(guò)修飾酶進(jìn)行鄰近標(biāo)記是一種新的PPI篩選方法，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)瞬時(shí)和弱相互作用的檢測(cè)。將修飾酶與感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行融合，修飾酶就能對(duì)目的蛋白附近及潛在相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。此類(lèi)技術(shù)的實(shí)例包括使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP，horseradish peroxidase），抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APEX，engineered ascorbate peroxidase）和鄰近依賴(lài)生物素標(biāo)記（BioID）的選擇性蛋白質(zhì)組鄰近標(biāo)記[4]。BioID技術(shù)相比傳統(tǒng)的蛋白相互作用發(fā)現(xiàn)方法具有顯著優(yōu)勢(shì)，適用于鑒定瞬時(shí)性、弱相互作用、不溶性細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及機(jī)體內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程。本文主要對(duì)BioID鄰近依賴(lài)生物素鑒定進(jìn)行總結(jié)歸納，闡述了其原理和方法及其在腫瘤疾病中蛋白相互作用鑒定的應(yīng)用。

1 BioID技術(shù)的策略

1.1 生物素連接酶（BirA）

2001年，Parrott等人[5]提出BirA可用于生物素化蛋白質(zhì)，并將其應(yīng)用在分泌蛋白或膜結(jié)合蛋白上。BirA屬于生物素連接酶的一種，來(lái)源于大腸桿菌，大小約為35.5 kDa，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，中心催化結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域，其中心催化結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合ATP并與靶蛋白相互作用[6]。de Boer等人[7]首次成功應(yīng)用了基于BirA的體內(nèi)生物素化，利用BirA檢測(cè)到了能與目標(biāo)蛋白GATA-1（紅系特異核蛋白轉(zhuǎn)錄因子）相互作用的分子，從而找到其潛在的分子靶點(diǎn)。2004年，Choi-Rhee等人[8]對(duì)生物素連接酶BirA進(jìn)行突變研究，通過(guò)篩選得到一種BirA的突變體BirA*（R118G）。2012年，Roux 等人[6]將這種利用BirA的突變體BirA*（R118G）在細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記相互作用蛋白的方法稱(chēng)為BioID。該一系列的工作奠定了將BirA蛋白用于鄰近相互作用堅(jiān)定的工作基礎(chǔ)。

1.2 BioID的技術(shù)原理

BioID通過(guò)生物素連接酶BirA來(lái)篩選生理相關(guān)的蛋白質(zhì)，野生型BirA僅能標(biāo)記一個(gè)蛋白，BioID利用大腸桿菌BirA*（R118G）的突變形式，促進(jìn)近端蛋白的生物素化[6]。野生型BirA生物素化是一個(gè)兩步反應(yīng)，先是BirA催化生物素和ATP生成活化的biotinoyl-5'-AMP中間體，并將其保持在自身的活性位點(diǎn)上，即中心催化結(jié)構(gòu)域上;隨后與靶蛋白上的特定賴(lài)氨酸反應(yīng)，在生物素和賴(lài)氨酸側(cè)鏈之間形成酰胺鍵，形成生物素化的靶蛋白，釋放出AMP。BirA需要特異性識(shí)別一段15個(gè)氨基酸的序列來(lái)生物素化目的蛋白，這樣的要求大大減少了潛在的目標(biāo)蛋白質(zhì)的數(shù)量。相反，BirA的突變形式BirA*，在活性位點(diǎn)攜帶R118G突變，且活性比BirA高，對(duì)biotinoyl-5'-AMP的親和力顯著降低并提前釋放，從而導(dǎo)致活化的biotinoyl-5'-AMP脫離催化中心，非特異性地與鄰近蛋白質(zhì)上的伯胺進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，即突變的BirA*不需要識(shí)別特定的氨基酸也能使其周?chē)姆肿由锼鼗痆9，10]。但BirA*的標(biāo)記半徑僅為10nm左右，在目的蛋白附近10nm范圍內(nèi)的蛋白都會(huì)被生物素化而被鑒定出來(lái)。因此只能對(duì)鄰近蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)非特異性的標(biāo)記，需要謹(jǐn)慎解釋陰性結(jié)果，因?yàn)樵诜治鲋锌赡苓z漏了一些已知的相互作用伴侶[11]。

在2016年，Kim和Roux等人[12]對(duì)BioID進(jìn)行了改進(jìn)，提出了BioID2，基于來(lái)自超嗜熱菌（A. aeolicus）的BirA（R40G），缺乏DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分子量更?。?7kDa），有利于準(zhǔn)確定位融合蛋白及與靶蛋白結(jié)合，且需要加入的生物素少于第一代BioID，生物素化標(biāo)記效率更高。與 BioID 相比，BioID2的生物素化范圍和效率顯著增強(qiáng)，因此能夠檢測(cè)到第一代連接酶難以生物素化的蛋白質(zhì)[12]。

1.3 BioID的技術(shù)流程

BioID分析過(guò)程可分為：（1）在哺乳動(dòng)物（或其它）表達(dá)載體中生成和表征BioID 融合蛋白以穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;（2）使用該細(xì)胞系用于大規(guī)模 BioID pull down并通過(guò)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)候選物。BioID 技術(shù)的操作主要包括以下流程：（1）構(gòu)建BioID融合蛋白的表達(dá)載體，穩(wěn)定表達(dá)融合BirA的目的蛋白;（2）在特定條件下添加生物素誘導(dǎo)，生物素化目的蛋白附近的蛋白;（3）提取總蛋白并將其與鏈霉親和素磁珠結(jié)合孵育，富集被生物素化的蛋白;（4）利用Western-blot以及質(zhì)譜分析的方法，對(duì)富集到的生物素化蛋白進(jìn)行鑒定[13]。

2 BioID在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

BioID技術(shù)通過(guò)BirA*形成融合蛋白來(lái)鑒定蛋白相互作用，而蛋白相互作用在腫瘤等疾病的發(fā)生過(guò)程中也是時(shí)刻存在的，利用BioID技術(shù)對(duì)腫瘤發(fā)生過(guò)程中的蛋白進(jìn)行標(biāo)記，再結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，就有可能找到相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，解釋腫瘤發(fā)生的機(jī)制。因此，BioID技術(shù)逐漸被應(yīng)用于腫瘤機(jī)制的研究及藥物靶點(diǎn)的篩選。

Ras蛋白是Ras基因表達(dá)產(chǎn)物，分子量為21kDa，屬于單體GTP結(jié)合蛋白，具有GTPase活性。野生型Ras受到機(jī)體嚴(yán)格的調(diào)控，其與GTP結(jié)合時(shí)為活性狀態(tài)，而與GDP結(jié)合時(shí)為非活性狀態(tài)，形成一種動(dòng)態(tài)平衡，但平衡會(huì)被Ras的突變所打破。在大約三分之一的人類(lèi)癌癥中發(fā)現(xiàn)了三種主要Ras亞型HRAS、NRAS和KRAS的突變，但由于Ras的結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，靶向治療仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[14]。以往的蛋白質(zhì)組學(xué)分析受到實(shí)驗(yàn)工具的限制，無(wú)法捕捉Ras在細(xì)胞中相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程及瞬態(tài)性質(zhì)。Kovalski等人[15]將BioID技術(shù)與CRISPR篩選相結(jié)合，鑒定Ras依賴(lài)癌細(xì)胞生長(zhǎng)所需的Ras近端蛋白質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)對(duì)野生型Ras蛋白和三種突變型Ras蛋白均進(jìn)行了BioID實(shí)驗(yàn)，將BirA*與野生型Ras蛋白及三種突變型Ras蛋白融合，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出了690個(gè)Ras近端蛋白，其中150個(gè)蛋白在3種Ras突變型中均存在，進(jìn)而確定了活性Ras和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）之間的相互作用，活性Ras能刺激mTORC2激酶活性。Ras-mTORC2相互作用激活下游促增殖轉(zhuǎn)錄程序，促進(jìn)Ras依賴(lài)性腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。

正常B細(xì)胞發(fā)育所必需的轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)常在B系急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）中發(fā)生突變，其中突變頻繁的蛋白質(zhì)包括轉(zhuǎn)錄因子PAX5，這些突變通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子功能的部分喪失。雖然PAX5的功能與人類(lèi)惡性腫瘤有明顯的關(guān)系，但是沒(méi)有足夠的證據(jù)表明PAX5的雜合子缺失對(duì)B細(xì)胞祖細(xì)胞的發(fā)育和功能有顯著影響，因此PAX5可能是B-ALL靶向的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)組成部分[16]。Okuyama等[17]為了研究與PAX5相關(guān)的功能網(wǎng)絡(luò)，他們使用BioID技術(shù)在活細(xì)胞中分離與該轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的蛋白質(zhì)，將生物素連接酶BirA*與PAX5融合，融合蛋白在小鼠Abelson病毒轉(zhuǎn)化的Pre-B細(xì)胞系中表達(dá)，通過(guò)質(zhì)譜鑒定出239種蛋白質(zhì)，其中幾種蛋白在人類(lèi)B-ALL中發(fā)生了突變，包括IKZF1和RUNX1，通過(guò)BioID與ChIP-Seq兩種方法的應(yīng)用證明了PAX5是淋巴白血病靶向功能性轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的一部分，經(jīng)常被B-ALL中的多個(gè)突變所靶向，從而揭示白血病細(xì)胞中的分子相互作用。

作為去泛素酶，泛素羧基端水解酶UCH-L1屬于UCH亞家族，主要在腦組織中表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)水平較低，但在一些癌癥中發(fā)現(xiàn)了UCH-L1的過(guò)度表達(dá)，比如骨髓瘤、前列腺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等[18]。然而，UCH-L1在乳腺癌侵襲中的作用尚不清楚。Luo Y等人[19]研究發(fā)現(xiàn)UCH-L1在具有更高侵入能力的癌細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增高。雖然異位UCH-L1表達(dá)未能改變MCF-7（人乳腺癌）細(xì)胞中的細(xì)胞增殖，但它引起細(xì)胞侵襲的能力顯著上調(diào)。此外，siRNA介導(dǎo)的UCH-L1敲低導(dǎo)致UCH-L1過(guò)表達(dá)MCF-7細(xì)胞的侵襲抑制。為了研究這些觀察結(jié)果的分子機(jī)制，Luo Y等人通過(guò)BioID技術(shù)將BirA*與UCH-L1蛋白的N-末端融合，形成融合蛋白BirA*-UCH-L1，然后，我們?cè)贛CF-7細(xì)胞中表達(dá)了BirA*-UCH-L1，通過(guò)質(zhì)譜鑒定顯示UCH-L1可以與MCF-7細(xì)胞中的Akt相互作用。用His標(biāo)記的重組UCH-L1蛋白和MCF-7細(xì)胞裂解液進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明UCH-L1優(yōu)先結(jié)合Akt2用于Akt的活化。該實(shí)驗(yàn)證明UCH-L1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Akt的激活，也表明UCH-L1能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲，因此可以作為治療乳腺癌的潛在治療靶標(biāo)。

肺癌是導(dǎo)致全球癌癥死亡的主要因素之一，鱗狀細(xì)胞癌（SQCC）是肺癌中比較常見(jiàn)，屬于非小細(xì)胞肺癌的一種。SQCC被認(rèn)為起源于支氣管基底細(xì)胞，通過(guò)吸煙引起的損傷反應(yīng)導(dǎo)致該干細(xì)胞群體發(fā)生增生性鱗狀病變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)證明，在94%的SQCC中3q26-28區(qū)域中SOX2的拷貝數(shù)增加，并通過(guò)穩(wěn)定干細(xì)胞的初始鱗狀損傷反應(yīng)和促進(jìn)浸潤(rùn)性癌的生長(zhǎng)在疾病進(jìn)展的早期和晚期起作用[20]。因此抗SOX2靶向策略可以幫助治療鱗狀細(xì)胞癌，Kim等人[21]使用BioID技術(shù)表征體內(nèi)SOX2的相互作用組，以期找出能夠間接干擾SOX2活性的新策略。該方案確定了82個(gè)高豐度的SOX2互動(dòng)蛋白，隨后在基底細(xì)胞和SQCC中都驗(yàn)證了SOX2與共激活因子EP300的相互作用，證明了EP300對(duì)于基底細(xì)胞中的SOX2活性是必需的，EP300拷貝數(shù)在SQCC中也是增加的，因此EP300可以作為治療鱗狀細(xì)胞癌的潛在治療靶標(biāo)。

3 結(jié)束語(yǔ)

自BioID技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，其在PPI的鑒定中廣泛應(yīng)用，也為腫瘤等疾病機(jī)制的研究和藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供了一種新的方法。BioID的優(yōu)勢(shì)在于它能夠識(shí)別與目標(biāo)蛋白質(zhì)間接或弱相互作用的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用中動(dòng)態(tài)過(guò)程及瞬時(shí)相互作用的鑒定。重要的是，這種方法的應(yīng)用非常簡(jiǎn)單，輸出信息豐富。但BioID技術(shù)也存在一些不足：（1）在BirA*的標(biāo)記范圍內(nèi)，位于目的蛋白附近的蛋白質(zhì)都會(huì)被生物素化而被鑒定出來(lái)，這是一種非特異性的標(biāo)記，可能會(huì)產(chǎn)生陰性結(jié)果，某些候選蛋白與目的蛋白之間并不存在相互作用;（2）通過(guò)BioID和質(zhì)譜方法鑒定出的候選蛋白的豐度不能代表候選蛋白與目的蛋白生物相關(guān)性的強(qiáng)弱;（3）BirA*本身具有一定的尺寸大小，可能會(huì)影響一些分子質(zhì)量較少的目的蛋白的功能及定位。2017年Munter等人[22]提出了Split-BioID，該方法將BirA*分成兩個(gè)片段，N端的BirA*和C端的BirA*，它們單獨(dú)存在時(shí)并不能發(fā)揮功能，但將N-BirA*和C-BirA*分別與兩個(gè)目的蛋白融合，當(dāng)這兩個(gè)融合蛋白質(zhì)因?yàn)橄嗷プ饔枚拷鼤r(shí)，N-BirA*和C-BirA*才能形成有功能的完整的BirA*，從而可以特異性地標(biāo)記目的蛋白復(fù)合物的相互作用蛋白。該方法將蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)與BirA*鄰近標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，有效解決了BioID非特異性標(biāo)記的問(wèn)題。2018年Stewart等人[23]開(kāi)發(fā)了一種新型的雙組分BioID技術(shù)（2C-BioID）用于鑒定蛋白質(zhì)的相互作用，先將生物素蛋白連接酶與目標(biāo)蛋白分開(kāi)表達(dá)，然后通過(guò)添加誘導(dǎo)二聚化試劑誘導(dǎo)二聚化形成BirA*與目標(biāo)蛋白的復(fù)合體，達(dá)到標(biāo)記鄰近相互作用蛋白的目的。在該方法中，將未誘導(dǎo)聚合樣品同樣進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，作為整個(gè)方案的對(duì)照組，來(lái)消除假陽(yáng)性率，提高BirA*標(biāo)記的特異性。隨著B(niǎo)ioID技術(shù)不斷的改進(jìn)與優(yōu)化，BioID技術(shù)將廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的鑒定、腫瘤機(jī)制的研究及藥物靶點(diǎn)的篩選中。

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