陳嘉敏　劉惠英　張向輝　鄧婷婷　魏蜜

摘要：采用單因素試驗方法優(yōu)化生防菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D2WM抑菌物質的提取效率，并對抑菌物質粗提取的儲藏特性展開研究，同時利用市售藥劑對菊迪基氏菌（Dickeya chrysanthemi）進行室內藥劑篩選，對比生防菌劑與市售藥劑的防治效果。結果表明，通過單因素優(yōu)化提取生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM中的抑菌物質，發(fā)現(xiàn)最佳提取溶劑為正丁醇，有機溶劑與發(fā)酵液體積比為1∶7、提取時間為0.5 h;抑菌物質具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外光照穩(wěn)定性，在處理溫度達100 ℃，紫外光照射12 h時，抑菌效果均沒有顯著性下降，抑菌圈仍有23 mm;當抑菌物質儲存180 d后，抑菌圈大小仍有16.33 mm。生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物對黑腐果膠桿菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌、菊迪基氏菌、丁香假單胞菌和黃單胞菌等植物病原菌均有良好的抑菌效果。測定的19種藥劑中對菊迪基氏菌有良好抑制作用的僅有新田秀才6號、中生菌素、噻霉酮和氯溴異氰尿酸4種;其中，以生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物作為對照藥劑，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果高于噻霉酮和氯溴異氰尿酸。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）D2WM;抑菌物質;抑菌效果;藥劑篩選

中圖分類號：S476? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0087-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.018? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation of the control effect of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens

D2WM on Dickeya chrysanthemi and its fungicides screening

CHEN Jia-min1，2，LIU Hui-ying1，2，ZHANG Xiang-hui1，DENG Ting-ting1，WEI Mi1

（1.Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables/College of Life Science and Technology，Hubei Engineering University，Xiaogan 432000，Hubei，China;2.College of Life Science，Hubei University，Wuhan 430062，China）

Abstract： Single factor test was used to optimize the extraction efficiency of Bacillus amyloliquefaciens D2WM antimicrobial substance， and the storage characteristics of crude extraction of antimicrobial substance were studied. The stability of crude extracts and the fungicides screening on Dickeya chrysanthemi were studied. The results of biocontrol agents and commercial agents were compared. The results indicated that the optimum extraction solvent was n-butyl alcohol， the volume ratio of organic solvent to fermentation broth was 1∶7， and the extracting time was 0.5 h. In addition， the antimicrobial substances showed excellent stability towards temperature and ultraviolet. The antimicrobial activity was not influenced when exposed at 100 ℃， or after treatment of ultraviolet irradiation for 12 hours， the size of the antimicrobial circle was still 23 mm. When the antimicrobial substances were stored for 180 days， the size of the antimicrobial circle was still 16.33 mm. The crude extracts of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens D2WM had good bacteriostatic effects on plant pathogens such as Pectobacterium atrosepticum， Pectobacterium carotovorum， Dickeya chrysanthemi， Pseudomonas syringae and Xanthomonas arboricola. Only New-tian Xiucai No. 6， Zhongshengmycin， benziothiazolinone and chloroisobromine cyanuric acid had good inhibitory effects on Dickeya chrysanthemi among the 19 tested medicines. It was found that the bacteriostatic effect of crude extract of biocontrol bacteria Bacillus amyloliquefaciens D2WM was higher than benziothiazolinone and chloroisobromine cyanuric acid.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens D2WM; antibacterial substances; antagonism effect; fungicides screening

菊迪基氏菌（Dickeya chrysanthemi）是一種引起軟腐病的革蘭氏陰性（G-）植物病原菌，屬于迪基氏菌屬（Dickeya）。該屬的寄主極為廣泛，包括各種農作物、果樹和觀賞植物等，如香蕉[1]、玉米[2]、甘薯[3]、菊花屬、石竹類屬、馬鈴薯、番茄、梨樹[4，5]等，在世界范圍內都會造成經濟產量和品質的嚴重損失。其中，化學殺菌劑具有廣譜、高效、快速等特點，在防治植物病害和保證作物產量方面有顯著作用，但不合理使用化學殺菌劑，會引起一系列的環(huán)境和社會問題[6]。而生物防治被認為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ㄖ籟7]，能夠有效兼治植物病害和環(huán)境污染等問題。因此，利用生防菌所產的抑菌物質防治植物病害成為目前國內外研究熱點，相關的微生物菌劑也不斷涌現(xiàn)[8]。有研究表明，能夠拮抗細菌性軟腐病的生物防治藥物主要是芽孢桿菌[9]。如殺菌劑Serenade TM和Sonata AS，其有效菌株是枯草芽孢桿菌QST 713和QST 2808[10]。2013年登記的Taegro，其有效菌株是解淀粉枯草芽孢桿菌變種Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens菌株FZB24;以及2015年，以一種解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）為成分的生物肥料Rhizo Vital42[11]。由于以生防菌中有效抑菌成分所制得的生物防治藥物在實際應用上會受到環(huán)境中土壤溫度、光照和土壤生態(tài)系統(tǒng)等因素的影響，致使防治效果降低或不穩(wěn)定[12]。因此，得到1株生防效果顯著、抑菌物質穩(wěn)定的生防菌具有重要意義。

篩選到的1株對菊迪基氏菌病菌有很好抑制作用的生防菌株解淀粉芽孢桿菌D2WM，采用單因素試驗方法優(yōu)化其抑菌物質的提取效率，并對粗提取抑菌物質的穩(wěn)定性、廣譜性和抑菌效果進行較全面的評價，同時利用市售藥劑對菊迪基氏菌進行室內藥劑篩選，對比生防菌劑與市售藥劑的防治效果，為菊迪基氏菌綜合防治措施提供一定的理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 蔬菜軟腐病菌菊迪基氏菌HUEU-9、生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM、黑腐果膠桿菌（Pectobacterium atrosepticum）、胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）和黃單胞菌（Xanthomonas arboricola）由湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室提供。

1.1.2? 供試藥劑及其他化合物? 供試藥劑為市售常用農藥，如表1所示。氯化鈉（AR）購于天津市凱通化學試劑有限公司;蛋白胨（BR）購于生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母粉（FMB）購于生工生物工程（上海）股份有限公司;正丁醇（AR）購于天津市富宇精細化工有限公司分析純。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

LB固體培養(yǎng)基：在上述LB液體培養(yǎng)基中加入18.0 g瓊脂。

1.1.4? 儀器與設備? 電子天平（JA2003C），上海越平科學儀器有限公司;恒溫搖床（TS-200B），上海天呈實驗儀器制造有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱（2HP-9050），上海索譜儀器有限公司;高速臺式離心機（GT10-1T），北京時代北利離心機有限公司;雙人單面凈化工作臺（SW-CJ-2D），蘇州凈化設備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器（LX-C75L），合肥華泰醫(yī)療設備有限公司;752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物提取方案的優(yōu)化? 將新鮮的解淀粉芽孢桿菌D2WM按1%的接種量接入滅菌的200 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)18 h后，將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，得無菌濾液。

1）有機溶劑的優(yōu)化。按照極性由低到高，分別選取石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇作為萃取溶劑，按1∶1（無菌濾液：有機溶劑）比例放入三角瓶中振蕩混勻1 h后于分液漏斗靜置，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法測定最優(yōu)抑菌效果。

2）有機溶劑萃取比例優(yōu)化。將最佳有機溶劑和無菌濾液比例分別按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9放入三角瓶中，振蕩混勻1 h后于分液漏斗靜置，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法測定最優(yōu)抑菌效果。

3）有機溶劑萃取時間優(yōu)化。將最佳有機溶劑和無菌濾液按最佳比例放入三角瓶中，混勻分別振蕩0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 h后于分液漏斗靜置，取有機相用旋轉蒸發(fā)儀抽提，得到的粗提物用1 mL甲醇溶解，采用抑菌圈法測定最優(yōu)抑菌效果。

1.2.2? 生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物的穩(wěn)定性評價? 根據暢濤等[13]檢測抑菌物質穩(wěn)定性的方法，略作改動，設置溫度、紫外光和儲藏時間3個因子來檢測解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物的穩(wěn)定性。

1）溫度的影響。將生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物分別在40、50、60、70、80、90、100、121 ℃下處理40 min后，采用抑菌圈法測定抑菌效果。

2）紫外光的影響。將生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物在紫外光下分別照射2、4、6、8、10、12 h后，采用抑菌圈法測定抑菌效果。

3）儲藏時間的影響。將生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物在4 ℃冰箱分別存放30、60、90、120、150、180 d，采用抑菌圈法測定抑菌效果。

1.2.3? 生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM抑菌效果評價? 將5種病原細菌（黑腐果膠桿菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌、菊迪基氏菌、丁香假單胞菌和黃單胞菌）分別于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，取20 μL病原細菌于LB固體培養(yǎng)基涂布，用抑菌圈法檢測不同濃度生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物抑菌效果。

1.2.4? 試驗藥劑初篩? 將19種供試藥劑用無菌水稀釋10倍作為母液，取新鮮病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9 20 μL于LB固體平板上涂布，用無菌打孔器均勻打3個孔，即3次重復，每孔加入20 μL供試藥劑母液，以無菌水為對照。觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，以確定室內毒力測定的待測藥劑。

1.2.5? 試驗藥劑的室內毒力測定? 采用抑菌圈法將初篩結果中抑制病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9效果最好的藥劑進行毒力測定，以解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物作為對照藥劑，將各試驗藥劑配成不同濃度梯度。在含菌的LB固體平板上均勻打3個孔，將藥劑加入孔中，市售藥劑以無菌水作對照，粗提物以甲醇為對照，放入30 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯抑菌圈后。用十字交叉法測定抑菌直徑。以解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物為對照藥劑，比較其與各試驗藥劑的抑菌效果。按以下公式[14]計算試驗藥劑對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9生長的抑制率。

抑菌率=（處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑）/處理抑菌圈直徑×100%

將抑制率轉換為幾率值[15]，求出供試藥劑濃度的對數(shù)值，建立毒力回歸方程式[16]，求出有效中濃度（EC50）。

2? 結果與分析

2.1? 生防菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM粗提物提取方法優(yōu)化

由圖1可以看出，4種有機溶劑萃取所得粗提物對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9均有一定抑菌作用，且按照有機溶劑極性從低到高的順序抑菌作用越來越強，而正丁醇萃取后抑菌圈大且清晰。說明提取解淀粉芽孢桿菌D2WM抑菌物質的最佳萃取溶劑為正丁醇。

由圖2可以看出，不同萃取比例提取所得粗提物對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9抑菌作用差異不顯著，而有機溶劑與無菌濾液萃取比例為1∶7時，抑菌圈最大，為23.5 mm;說明提取解淀粉芽孢桿菌D2WM抑菌物質的最佳萃取比例為1∶7（有機溶劑∶無菌濾液）。

由圖3可以看出，當萃取時間為0.50 h時，提取所得粗提物對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9抑菌效果最好，說明提取解淀粉芽孢桿菌D2WM拮抗物質的最佳萃取時間為0.50 h，抑菌圈最大，為23.6 mm。

2.2? 生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM的穩(wěn)定性評價

由圖4可知，當處理溫度低于100 ℃時，生防菌粗提物的抑菌效果沒有顯著性差異，說明解淀粉芽孢桿菌D2WM產生的抑菌物質在100 ℃以下具有較好穩(wěn)定性;當處理溫度達到100 ℃時，抑菌效果才開始顯著下降。由圖5可知，紫外光照射12 h內對生防菌粗提物的抑菌效果沒有顯著性影響，說明解淀粉芽孢桿菌D2WM產生的抑菌物質在紫外光照射下具有較好穩(wěn)定性。由圖6可知，當儲存60 d后抑菌效果開始降低，隨著儲藏時間的延長，抑菌效果呈緩慢下降趨勢，在180 d時，抑菌圈大小為16.33 mm。暢濤等[13]也發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌B-401所產抑菌物質在溫度為25～90 ℃、紫外光照射6 h時均有較好穩(wěn)定性，與本研究結果一致。

2.3? 生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物的抑菌效果評價

由表2可知，生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物對病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌、黑腐果膠桿菌、菊迪基氏菌、丁香假單胞菌、黃單胞菌均有抑菌效果，隨著濃度的減小抑菌效果除黑腐果膠桿菌外，均顯著降低。其中，對病原菌丁香假單胞菌抑菌效果最好，抑菌率達71.66%;對病原菌黑腐果膠桿菌抑菌效果最差。

2.4? 試驗藥劑初篩

采用抑菌圈法對19種市場上常用殺菌劑進行初篩，確定室內毒力待測藥劑。由表3可知，對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9有抑菌效果的有噻霉酮、氯溴異氰尿酸、中生菌素和新田秀才6號，抑菌圈直徑分別為23.0、10.5、15.0、16.5 mm，其余15種殺菌劑對病菌無抑菌作用。

2.5? 試驗藥劑的室內毒力測定

由表4可知，供試的4種市售殺菌劑對病原菌Dickeya chrysanthemi HUEU-9的生長都有抑制作用。其中，殺菌劑80%新田秀才6號EC50最低，為0.036 0 mg/mL，抑菌效果最好;其次是12%中生菌素和3%噻霉酮，EC50分別為0.237 6 mg/mL和0.564 5 mg/mL，抑菌效果較好;最后是50%氯溴異氰尿酸，EC50為2.057 2 mg/mL，在供試的4種殺菌劑中抑菌效果較差。其中，以生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM粗提物作為對照藥劑，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果高于3%噻霉酮和50%氯溴異氰尿酸，為0.302 5 mg/mL。

3? 小結與討論

結合抑菌物質的成熟提取方法，本試驗通過單因素初步優(yōu)化提取生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM中的抑菌物質，發(fā)現(xiàn)最佳提取溶劑為正丁醇，有機溶劑與無菌濾液萃取比例為1∶7，提取時間為0.5 h，該優(yōu)化方法可顯著減少生產成本的投入。目前，對生防菌中抑菌物質的提取方法優(yōu)化還未見報道。且通過抑菌圈法發(fā)現(xiàn)初步優(yōu)化提取所得生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM的抑菌物質具有良好的熱穩(wěn)定性和紫外光照穩(wěn)定性，在溫度低于100 ℃時，抑菌效果沒有顯著性下降，在紫外光照射12 h后抑菌效果也沒有顯著性影響，當抑菌物質儲存180 d后，抑菌圈大小仍有16.33 mm，而李占杰等[17]篩選到生防菌株CAB-1的抑菌物質在60 ℃及其以下具有熱穩(wěn)定性，紫外光照射50 min后其活性顯著降低;張華等[18]篩選到生防菌株B10-26的抑菌物質活性也隨著溫度的升高有所下降。李威等[19]篩選到生防菌株在4 ℃條件下貯藏28 d后抑菌活性開始顯著下降。由此說明，生防菌解淀粉芽孢桿菌D2WM的抑菌物質穩(wěn)定性優(yōu)于已報道的部分生防菌。此外，該生防菌對5種（黑腐果膠桿菌ZBX-2、胡蘿卜軟腐果膠桿菌ZX-1、菊迪基氏菌HUEU-9、丁香假單胞菌G1和黃單胞菌DW3F3）排名前十的植物病原細菌[20]均有不同程度的防治作用，可以解決大田內多種病原菌同時存在的問題。測定的19種市售殺菌劑中對菊迪基氏菌有良好抑制作用的僅有4種，其中，生防菌株抑菌物質作為對照藥劑的抑菌效果還高于3%噻霉酮和50%氯溴異氰尿酸。說明該生防菌防治病害效果不比化學殺菌劑差，具有市場應用前景和價值。

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收稿日期：2019-03-28

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31600055）;中國博士后項目（2018M642815）

作者簡介：陳嘉敏（1995-），女，湖北孝感人，在讀碩士研究生，研究方向為作物學，（電話）13733427825（電子信箱）1002359952@qq.com;

通信作者，魏? 蜜（1987-），女，湖北孝感人，副教授，博士，主要從事微生物學和植物病害生物防治，（電子信箱）weimi555@163.com。