盧漫漫，陳家耀，鈕鳴宇，吳衛(wèi)東

(1.廣西大學體育學院, 南寧 530001；2.貴港市人民醫(yī)院, 廣西 貴港 537100；3.廣西醫(yī)科大學, 南寧 530021；4.鄭州大學體育學院，廣西 鄭州 450044)

肝脂肪堆積和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)與某些代謝性疾病，如肥胖、2型糖尿病和心血管疾病相關[1]。脂肪肝是脂肪氧化和脂質積累缺乏控制的結果，導致肝臟中甘油三酯增加，因此肥胖與肝臟脂肪堆積有密切聯(lián)系。NAFLD誘導胰島素抵抗與脂肪肝脂肪變性加重，可導致肝纖維化和肝癌[2]。大量研究證實，有氧運動可抑制肝臟脂肪堆積和代謝紊亂[3,4]。

Tabata 等人報道，Cdc2 激酶(Cdc2-like kinase,CLK2)是細胞周期蛋白依賴性激酶，對脂肪酸氧化和肝酮生成有抑制作用[5]。這種蛋白在動物空腹狀態(tài)下肝組織中明顯減少，標準飼料喂養(yǎng)后升高。另一方面，Tabata等人也觀察到肥胖動物食用富含脂質食物，在空腹狀態(tài)下肝組織中CLK2含量也保持增高[5]。CLK2蛋白增高導致過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α)磷酸化相應增加，從而使脂肪酸氧化和酮體生成相關基因轉錄受到抑制，這種抑制有助于肝臟甘油三酯蓄積[5]。涉及CLK2蛋白研究很多，但是有氧運動對CLK2蛋白影響鮮有相關報道?；贑LK2蛋白在肝臟脂肪積累中的作用，有必要明確有氧運動對CLK2蛋白的影響。本研究旨在明確有氧運動對高脂飲食小鼠肝臟中CLK2蛋白的影響，為有氧運動的作用機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

30只雄性C57BL/6小鼠(10周，購于廣西大學動物中心)，體重20～25 g。存放在12 h光照和12 h黑暗清潔環(huán)境中，溫度為(22±1)℃，自由進食和飲水。飼養(yǎng)2 d后將小鼠隨機分為3組(n=10)：正常飲食組(ND)、高脂飲食組(HD)和高脂飲食+運動組(Trained HD)，均喂養(yǎng)16周。正常飲食組小鼠以標準飼料配方飼養(yǎng)(標準飲食：5%脂肪，22%蛋白質，51.5%碳水化合物)，同時不進行相關運動；高脂飲食組小鼠以高脂/高碳水化合物飲食飼養(yǎng)，高脂飲食飼料配方：20%蛋白、35%碳水化合物和45%脂肪(購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所)。高脂飲食+運動組小鼠高脂飲食喂養(yǎng)16周，并在9周時開始有氧運動。

1.2 實驗儀器和試劑

小鼠跑步機(上海玉研科學儀器有限公司)；PCR儀(美國ABI公司)；油紅O染色液(上?；鄯f生物科技有限公司)；RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；CLK2 抗體(美國Santa公司)；基因特異性引物由上海生工合成。

1.3 有氧運動

小鼠首先在跑步機上進行5 d的適應，速度為10 m/min。高脂飲食+運動組小鼠在高脂飲食喂養(yǎng)第9周后開始有氧運動。在前4周中，小鼠在第1周內跑15 min，在第2周跑30 min，第3周內跑45 min，第4周60 min，每周5 d。第2個4周中，60 min/d，每周5 d[6]。

1.4 高胰島素-正糖鉗夾試驗

在實驗期間，采用分析天平每周對每只小鼠稱重。16周喂養(yǎng)后，每組小鼠禁食過夜。腹腔注射異戊巴比妥鈉麻醉(25 mg/kg)后，暴露雙側頸動脈，將注射葡萄糖和胰島素插管置于小鼠右頸靜脈，另一插管置于左頸動脈以便提取血樣。使用注射泵儲存葡萄糖和胰島素溶液。胰島素以mU·kg-1·min-1的速率經頸靜脈插管注入，血糖儀連續(xù)監(jiān)測血糖水平，每隔5 min調整葡萄糖輸注率(glucose infusion rate, GIR)以維持血糖水平在(5.0±0.5)mmol/L。90 min內達到穩(wěn)態(tài)并維持30 min，最后60 min平均GIR(Mean GIR60-120 min)用于評價小鼠對胰島素的敏感性。

1.5 免疫印跡分析

16周后每只小鼠1.5 IU/kg劑量胰島素腹腔注射，10 min后，取肝臟并放入液氮中，然后提取小鼠肝臟蛋白，取30g進行SDS-PAGE電泳，然后轉至PVDF膜上。經5%牛奶孵育1 h后，用磷酸鹽緩沖液洗膜3次，每次10 min。用兔源CLK2和鼠抗-actin多克隆抗體(1∶2 000)4℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1∶25 000)，室溫孵育1 h。用化學發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測CLK2蛋白表達并攝片，采用Quantity one圖像分析軟件對吸光度積值進行分析。以CLK2蛋白吸光度值和-actin比值表示蛋白表達水平。

1.6 實時定量PCR

首先取小鼠肝臟總RNA，然后進行反轉錄反應，使用小鼠過氧化物酶體增殖物活化受體-α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPAR-α)、肉毒堿棕櫚?；D移酶-1α(carnitine palmitoyltransferase-1 alpha, CPT-1α)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase, SCD1)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)基因特異性引物進行實時定量RT-PCR擴增。引物序列如下：PPAR-α-F,5’TGCCTGTCTGTTGGGATGT-3’;PPAR-α-R,5’ TGGCTTCATACACACCGTACTT -3’.CPT-1α-F,5’TATGTGAGGATGCTGCTTCC-3’;CPT-1α-R,5’CTCGGAGAGCTAAGCTTGTC-3’.SCD1-F,5’TGCTGATGTGCTTCATCCTG-3’;SCD1-R, 5’GGGA AACCAGGATATTCTCC-3’.FAS-F,5’ CAAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG-3’; FAS -R,5’TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG -3’。通過分析軟件得到每組的Ct，其中U6 RNA作為內參照；參照文獻報道的方法，按下述公式進行比較不同處理后基因相對表達的計算：相對基因表達=2。

1.7 油紅O染色法檢測小鼠肝臟脂肪含量

16周后，提取小鼠肝臟用10%甲醛固定。采用冰凍切片機對肝臟縱向切割，厚度為10 μm，放置在粘附玻片上。隨后油紅O溶液將玻片染色25 min，在用蘇木精染色2 min，此后，用明膠密封玻片。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 有氧運動對生理代謝參數(shù)影響

與正常飲食組相比，高脂飲食組體重明顯增加，而高脂飲食+運動組小鼠體重明顯降低(圖1)。與高脂飲食組小鼠相比，高脂飲食+運動組小鼠空腹血糖和空腹胰島素顯著降低，而GIR顯著增加(表1)。結果表明有氧運動能夠改善高脂飲食小鼠胰島素敏感性，減少空腹血糖和胰島素。

Fig. 1 Weight curve of three groups of mice(n=10)

ND: Normal diet; HD: High fat diet

*P<0.05 HDvsND;#P<0.05 Trained HDvsHD;&P<0.05 Trained HDvsND

GroupFastingbloodsugar(mg/dl)Fastinginsulin(ng/dl)MeanGIR(mg/(kg·min))ND140.3±13.63.4±0.713.8±2.7HD290.5±20.7?7.0±1.3?7.5±1.8?TrainedHD183.8±15.93.9±0.811.9±2.6

*P<0.05vstrained HD

2.2 有氧運動對肝臟CLK2蛋白影響

免疫印跡結果顯示，與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠肝臟CLK2蛋白水平明顯增加(1.0± 0.1vs1.7±0.2,P<0.05)，而高脂飲食+運動組小鼠鼠肝臟CLK2蛋白水平顯著降低相對于高脂飲食組小鼠(1.1±0.1vs1.7±0.2,P<0.05，圖2)。

Fig. 2 Aerobic exercise reduces Cdc2-like kinase(CLK2)level in liver of obese mice(n=5)

2.3 有氧運動對肝臟脂質含量影響

由于CLK2蛋白與肝臟脂肪累積相關，因而下一步評估不同組小鼠肝臟脂質含量。油紅O染色結果顯示，與正常飲食組小鼠比較，高脂飲食組小鼠肝細胞染色發(fā)生改變，高脂飲食小鼠肝臟脂肪含量增加(1.0±0.1vs4.0±0.3,P<0.01)；然而高脂飲食+運動組小鼠肝臟脂肪降低(4.0±0.3vs1.2± 0.1,P<0.01，圖3)。

Fig. 3 Liver fat accumulation of mice in three groups(n=5)

2.4 有氧運動對氧化及脂肪合成基因表達影響

實時定量PCR結果顯示，高脂飲食未改變脂肪代謝相關基因，如PPAR-α和CPT-1αmRNA水平；另一方面，有氧運動可增加上述基因表達(P< 0.05)。而3組小鼠間SCD1和FASmRNA水平無統(tǒng)計學差異(表2)。

GroupPPAR-αCPT-1αSCD1FASND1.0±0.11.0±0.11.0±0.11.0±0.1HD0.8±0.10.7±0.10.8±0.11.1±0.1TrainedHD2.0±0.2?2.1±0.2?0.7±0.10.9±0.1

*P<0.05vsHD

3 討論

本研究表明，有氧運動可使高脂飲食小鼠肝臟中CLK2蛋白下調，這可能與肝臟脂肪堆累積減少有關。以往研究證實，CLK2蛋白存在于肝細胞中，參與脂質生成[7]。在本研究中，高脂飲食喂養(yǎng)小鼠16周后肝臟CLK2蛋白含量增加。相比較，高脂飲食小鼠進行有氧運動訓練可降低肝臟CLK2蛋白水平和脂肪蓄積。這些結果表明，有氧運動可能減少肝臟脂肪堆積，改善代謝健康。大量研究表明，肝臟脂肪堆積與運動較少及飲食質量有關，有助于肥胖的發(fā)展。肥胖和脂肪肝脂肪變性可導致血液中葡萄糖和胰島素升高、血脂異常、動脈粥樣硬化、2型糖尿病和心血管疾病等[8,9]。而運動是臨床上常用于解決上述代謝和健康問題的非藥物方法[10]。眾所周知，合理的生活方式有助于預防和改善各種健康問題。我們的研究結果提示，有氧運動在機體代謝過程中發(fā)揮積極作用，在CLK2蛋白參與下，可抑制肝臟脂肪堆積。

如前所述，CLK2可調控肝細胞中脂肪酸的相關基因表達[7]。事實上，肥胖動物表現(xiàn)出CLK2蛋白含量增加，肝臟脂肪氧化減少。在肝臟CLK2敲除小鼠模型中，脂肪酸氧化相關基因表達增加，可抑制肝臟中脂肪積累[7]。在本研究中，高脂飲食小鼠肝臟CLK2蛋白水平增高，而有氧運動可使其降低。CLK2蛋白對肝臟代謝影響已有報道，由于其與過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PGC-1α)的直接作用，CLK2可抑制PGC-1α活性，從而導致糖異生基因表達增高[11]。雖然CLK2蛋白也參與肝臟中糖原合成，但CLK2蛋白主要在脂肪酸氧化調節(jié)中發(fā)揮作用[7]。事實上，肝臟中CLK2基因敲除肥胖動物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6-磷酸酶基因表達增加[11]。CLK2短期作用中，對PGC-1α有抑制作用，但對糖異生的影響較小[11]。在本研究中，我們沒有分析直接參與糖異生的蛋白和基因，但我們觀察到，長期有氧運動可降低了血液中葡萄糖，并增加胰島素敏感性?？赡芘c運動對糖異生的影響有關。本研究也評估了CLK2蛋白與游離脂肪酸新陳代謝的關系。未運動高脂飲食小鼠肝臟甘油三酯和血清脂肪酸水平增高，但這些參數(shù)在有氧運動肥胖小鼠中降低。很少有研究報道CLK2蛋白在肝臟脂肪堆積相關的代謝調控、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和能量消耗中的作用。有氧運動后CLK2蛋白下降的具體機制也不清楚。與此同時，高脂飲食小鼠肝臟中甘油三酯、脂肪積累及血液中游離脂肪酸水平增高，而有氧運動可降低高脂飲食小鼠中上述參數(shù)[12,13]。參與脂肪氧化和脂肪酸合成的基因中，本研究表明進行有氧運動的高脂飲食小鼠脂肪氧化基因表達增加。在脂肪合成基因中，轉錄后調控或控制蛋白機制可能與組間小鼠無差異有關。運動對肝細胞中CLK2蛋白降低的影響與肝臟脂肪含量與脂肪氧化基因減少有關。上述結果表示，CLK2蛋白可能參與肝臟代謝，特別是脂肪氧化。結果也提示，高脂飲食小鼠通過有氧運動減少肝臟脂肪部分通過降低CLK2蛋白含量而發(fā)生的。

綜上所述，有氧運動可能通過調節(jié)肝臟中CLK2蛋白，改善高脂飲食小鼠肝臟脂肪堆積和代謝紊亂，對于明確有氧運動的作用機制有重要意義。