王 寅，徐穎杰，葉永剛

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)屬于臨床常見心血管疾病之一，AMI發(fā)病率、死亡率極高，部分病人在住院期間會(huì)并發(fā)心力衰竭(heart failure，HF)，調(diào)查顯示AMI后HF的發(fā)生率達(dá)30%，死亡率達(dá)20%[1]，因此，及時(shí)診斷并控制AMI發(fā)展對(duì)于延長病人生存期、改善病人預(yù)后十分重要。以往研究顯示肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)等血清生物標(biāo)志物廣泛用于AMI、HF臨床診斷，但由于假陽性率較高，臨床應(yīng)用受限[2]，因此，尋找高效生物學(xué)標(biāo)志物十分重要。微小RNA(micro RNA，miRNA)在心肌組織中的異常表達(dá)與各種心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3]。另外，miRNA在外周血表達(dá)非常穩(wěn)定、易獲取，可作為心臟疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。本研究旨在探討miR-210是否可以作為AMI合并HF診斷、預(yù)后的新型生物標(biāo)志物，以期為AMI疾病的診斷、治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年5月—2015年4月在我院治療的92例AMI病人及85例AMI合并HF病人，納入標(biāo)準(zhǔn)：①AMI病人經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷及冠狀動(dòng)脈造影檢測(cè)等符合歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)頒布的第三版急性心肌梗死全球定義(2012版本)[4]；②AMI合并HF病人符合ESC頒布的第三版急性心肌梗死全球定義及急慢性心力衰竭診療指南[5]；③年齡18～78歲；④AMI合并HF者心功能Killip分級(jí)2～4級(jí)；⑤病人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①川崎病、冠狀動(dòng)脈疾病等導(dǎo)致AMI；②瓣膜型心臟病、病毒心肌炎、心絞痛等導(dǎo)致的AMI；③既往接受過外科搭橋手術(shù)治療；④肝腎功能嚴(yán)重受損；⑤腦血管、腫瘤病人。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 病人入院后記錄年齡、性別，并測(cè)量心率、血壓、血脂，統(tǒng)計(jì)發(fā)病常見危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、是否吸煙、AMI家族史等；同時(shí)采用Sonoline G50多普勒超聲檢測(cè)儀(德國西門子)檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)值。

1.2.2 血清樣本收集 所有受試者入院后次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min后，收集上清置于-20 ℃保存。

1.2.3 血清cTnI檢測(cè) 采用膠體金法檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)檢測(cè)血清cTnI水平，于25 ℃下進(jìn)行操作，取出檢測(cè)卡放置水平位置并標(biāo)記，滴加4滴待測(cè)樣本，以垂直方向滴加于加樣處，待T線處出現(xiàn)紫紅色條帶，采用標(biāo)準(zhǔn)比色卡對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，檢測(cè)范圍1～50 ng/mL。

1.2.4 血清B型利鈉肽(b-type natriuretic peptide，BNP)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清BNP水平，根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所)操作：在酶標(biāo)包被板設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，分別添加100 μL樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，封膜后在37 ℃環(huán)境中孵育2 h，洗滌、甩干后，先添加100 μL顯色液A，封膜后37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌、甩干后，添加顯色液100 μL B工作液，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板，每孔添加50 μL底物溶液，覆膜37 ℃避光顯色20 min，添加終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測(cè)量各孔的光密度(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-210表達(dá) 采用miRNA提取試劑盒(Applied Biosystems，美國)，根據(jù)說明書提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR反應(yīng)試劑盒(Taraka，日本)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×miRNA SYBR Premix 10 μL，cDNA 樣品1 μL，F(xiàn)orward及Reverse引物分別0.6 μL，補(bǔ)充無核酸酶水至20 μL。于PCR儀(Bio-Rad，美國)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序設(shè)定：94 ℃預(yù)變性 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性 20 s，60 ℃退火 35 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)定3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，以U6作為內(nèi)部參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-210相對(duì)表達(dá)量變化。

1.2.6 隨訪 病人均進(jìn)行36個(gè)月隨訪，截止日期為2018年4月30日，采用復(fù)診或電話方式進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計(jì)病人死亡人數(shù)。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①缺血性胸痛持續(xù)時(shí)間>30 min，且服用硝酸甘油藥物后不能緩解；②心電圖改變：2個(gè)相鄰ST段抬高>0.1 mV；③血清學(xué)標(biāo)志物如心肌肌鈣蛋白、肌酸激酶水平升高1倍以上；④冠狀動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈分支存在血管病變。HF診斷標(biāo)準(zhǔn)：①病人出現(xiàn)呼吸困難及疲勞等典型臨床表現(xiàn)；②肺部1/3以上部分出現(xiàn)濕啰音；③影像學(xué)發(fā)現(xiàn)肺阻塞、肺水腫；④不正常水平的腦鈉肽。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 AMI合并HF組AMI病史比例、CK-MB水平均高于AMI組，LVEF低于AMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組年齡、性別、高血壓、糖尿病、心率、血壓、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 AMI組與AMI合并HF組臨床資料比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。SBP為收縮壓；DBP 為舒張壓；LDL 為低密度脂蛋白；WBC為白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.2 兩組血清miR-210、cTnl、BNP水平比較 AMI合并HF組血清miR-210、cTnl、BNP水平均高于AMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別例數(shù)miR-210cTnl(ng/mL)BNP(pg/mL)AMI組 921.05±0.340.67±0.120.63±0.12 AMI合并HF組 85 1.73±0.482.33±0.641.44±0.26t值-10.940-24.423-25.624P 0.000 0.000 0.000

2.3 miR-210與cTnl、BNP相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-210與cTnl呈正相關(guān)(r=0.365，P=0.000)；與BNP呈正相關(guān)(r=0.304，P=0.000)。詳見圖1、圖2。

圖1 血清miR-210與cTnl的相關(guān)性分析

圖2 血清miR-210與BNP的相關(guān)性分析

2.4 影響AMI病人發(fā)生HF的多因素分析 以AMI合并HF作為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的AMI病史、miR-210、cTnl、BNP、LVEF、CK-MB作為自變量進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，AMI病史、miR-210、cTnl、BNP為AMI合并HF的危險(xiǎn)因素。詳見表3。

表3 AMI病人發(fā)生HF的Logistic多因素回歸分析

2.5 miR-210對(duì)AMI合并HF的診斷價(jià)值 ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-210對(duì)AMI合并HF、AMI具有一定的區(qū)分能力，miR-210診斷AMI合并HF的AUC為0.850(95%CI0.813～0.914)，約登指數(shù)為0.667，臨界值為1.357，診斷敏感性為77.65%，特異性為89.13%。詳見圖3。

圖3miR-210在AMI合并HF診斷中的ROC分析

2.6 miR-210與AMI合并HF預(yù)后的關(guān)系 病人均隨訪3年，共死亡18例，存活率為78.82%。根據(jù)血清miR-210中位值，將病人分為miR-210高表達(dá)組、miR-210低表達(dá)組，其中miR-210高表達(dá)組39例，死亡12例，存活率為69.23%；miR-210低表達(dá)組46例，死亡6例，存活率為86.96%；miR-210低表達(dá)組存活率高于miR-210高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.973，P=0.046)。詳見圖4。

圖4 miR-210預(yù)后生存曲線分析圖

3 討 論

AMI合并HF是臨床上常見的心腦血管疾病，其發(fā)病驟然、病情進(jìn)展迅速、死亡率較高，嚴(yán)重威脅人類健康[6]。盡早診斷采取合適的治療對(duì)改善AMI合并HF病人預(yù)后十分重要。臨床研究表明，AMI合并HF發(fā)病早期并無臨床特異表現(xiàn)，僅有部分病人心電圖顯示異常[7]。cTnI作為AMI及HF診斷常用的血清學(xué)標(biāo)志物，雖診斷敏感性較高，但在其他疾病如急性或慢性腎衰竭病人中也可檢測(cè)到肌鈣蛋白T(cTnT)水平的升高[8]，特異度較低。因此，探尋高效的血清標(biāo)志物對(duì)AMI合并HF的臨床診斷具有重要價(jià)值。

miRNA為非編碼RNA分子，長度為21～25 nt，通過靶向結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低其靶基因表達(dá)水平[9]。研究證實(shí)，miRNA的異常表達(dá)與AMI、HF等多種心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，為發(fā)病機(jī)制中的重要調(diào)控基因[10]。一般情況下miRNA在血清中表達(dá)較穩(wěn)定，容易檢測(cè)，且miRNA具有組織特異性，血清miRNA的水平也具有差異。基于以上優(yōu)點(diǎn)，血清miRNA可能成為疾病診斷及預(yù)后判定的生物學(xué)標(biāo)志物。然而，關(guān)于AMI合并HF病人中外周血miRNA研究不多。

miR-210在心肌系統(tǒng)缺氧缺血調(diào)控中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，冠心病病人心肌長期血流供應(yīng)不足，導(dǎo)致心肌缺氧，隨著時(shí)間的延長，心肌細(xì)胞數(shù)量降低后，心功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致心力衰竭[11]。在細(xì)胞缺氧缺血后，miR-210水平均升高，在多個(gè)miRNA異常表達(dá)中最顯著[12]。此外還有研究證實(shí)，miR-210在缺氧后可能受到缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的誘導(dǎo)后水平升高，故可反映缺氧程度[13]。有研究顯示，HF模型大鼠miR-451與miR-210水平均明顯升高[14]。Zhao等[15]通過對(duì)比心力衰竭組、健康組、胎兒組血清miR-210水平發(fā)現(xiàn)，心力衰竭組血清miR-210水平顯著升高，且與胎兒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上研究均提示，血清miR-210水平的異常表達(dá)與心力衰竭的發(fā)生有關(guān)，然而在AMI合并HF中的表達(dá)情況，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與AMI組相比，AMI合并HF組血清miR-210水平顯著升高，與以往研究相符，提示miR-210可能參與AMI合并HF的發(fā)生。

BNP為心室肌細(xì)胞分泌的短肽激素，研究證實(shí)AMI發(fā)生后，利鈉肽系統(tǒng)被激活導(dǎo)致血清中BNP水平均顯著升高[16]。多項(xiàng)研究證實(shí)BNP水平與HF病人病情嚴(yán)重程度有關(guān)，且高水平BNP預(yù)示HF病人預(yù)后不佳[17]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI合并HF病人血清BNP水平明顯升高，且與miR-210呈正相關(guān)，由此推測(cè)miR-210可能參與AMI合并HF的發(fā)生發(fā)展過程。HF發(fā)生后，心肌細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離cTnI進(jìn)入血液中，導(dǎo)致其水平升高，且其水平的持續(xù)升高會(huì)破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此，cTnI水平可反映心肌損傷及病情程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI合并HF病人血清cTnI水平明顯升高，且與miR-210呈正相關(guān)，由此推測(cè)miR-210可能與AMI合并HF病情有關(guān)。

為進(jìn)一步明確miR-210與AMI合并HF發(fā)生的關(guān)系，本研究采用Logistic多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)miR-210為AMI合并HF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。基于miR-210在AMI病人、AMI合并HF病人中的表達(dá)差異，可能成為AMI合并HF發(fā)生的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，可能對(duì)AMI合并HF具有潛在的診斷價(jià)值。本研究采用ROC曲線分析顯示，miR-210診斷AMI合并HF的AUC值為0.850(95%CI0.813～0.914)，約登指數(shù)為0.667，臨界值為1.357，診斷敏感性為77.65%，特異性為89.13%，提示血清miR-210對(duì)AMI合并HF具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

越來越多的研究顯示，miRNA可對(duì)心臟疾病預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。血漿hsa-miR-30a升高是高血壓左室肥厚病人預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[19]。AMI病人血清miR-1水平較低者術(shù)后恢復(fù)較好。符雅菁等[20]研究顯示，AMI病人血清中miR-214水平與冠狀動(dòng)脈狹窄范圍及預(yù)后有關(guān)。本研究經(jīng)過KM生存曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-210高表達(dá)者3年生存率低于低表達(dá)者，提示miR-210高表達(dá)者病情嚴(yán)重，預(yù)后不佳。

綜上所述，血清miR-210水平在AMI合并HF病人中升高，與BNP、cTnI相關(guān)，且為AMI合并HF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與病人不良預(yù)后有關(guān)。但是，由于AMI合并HF發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，本研究僅從臨床角度探究其表達(dá)意義，而關(guān)于分子機(jī)制缺乏相關(guān)研究，因此，仍然需要繼續(xù)深入的研究，為AMI合并HF的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)。