茹月蓉 - 張之楊 - 楊金梅 - 何 斌 闞 歡 劉 云 王振興 - 張雪春 -

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)森林食品研究院，云南 昆明 650224)

青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)別名青岡樹(shù)、青栲、鐵稠等，為殼斗科青岡屬常綠闊葉林樹(shù)種，具有較高的生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。青岡櫟果實(shí)是青岡櫟樹(shù)的種子，由種仁和果殼組成，種仁中含有較高含量的淀粉、油脂、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，可釀酒、榨油和加工成漿紗、粉條、糕點(diǎn)、酒精和飼料等，屬于綠色食品原料[2-3]；其含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]等功能活性。青岡櫟果殼作為青岡櫟果實(shí)的主要副產(chǎn)物，往往被丟棄，而有關(guān)其成分和功能活性的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道?；谠S多殼斗科植物如板栗[7]、甜櫧[8]等，除種仁外，其外殼、根、葉也含有大量的植物多酚。植物多酚又名單寧，是植物的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗動(dòng)脈硬化以及防治冠心病等多種功能活性[9-10]。

目前提取植物中活性成分的方法主要有超聲波輔助提取、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取、微波輔助提取等方法[11]。其中超聲波技術(shù)可有效破壞原料細(xì)胞壁，加速溶劑擴(kuò)散和溶質(zhì)流出，且對(duì)原料中化合物的結(jié)構(gòu)和活性的破壞較小，具有環(huán)境友好、成本低、高效率、耗時(shí)短的特點(diǎn)，適用于青岡櫟果殼等外殼堅(jiān)硬的物料提取[12-13]。試驗(yàn)擬以青岡櫟果殼為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取其多酚類物質(zhì)的工藝條件，并評(píng)估提取物的體外抗氧化能力，以期為青岡櫟的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料和試劑

青岡櫟果實(shí)：江蘇省宿遷市沭陽(yáng)縣；

乙醇、沒(méi)食子酸、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、鹽酸、抗壞血酸(VC)、三氯化鐵、乙酸、磷酸、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸亞鐵、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、過(guò)硫酸鉀：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

Folin-Ciocalteus試劑、2，2′-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫(AAPH)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、三羥甲基氨基甲烷(THAM)、鄰苯三酚、熒光素鈉(FL)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，上海力辰邦西儀器儀器有限公司；

電子天平：AX224ZH型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

超聲波清洗器：SG5200HDT型，上海冠特超聲儀器有限公司；

循環(huán)水真空泵：SH2-D(III)型，邦西儀器科技有限公司；

酶標(biāo)儀：SynergyH1型，美國(guó)伯騰儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1001型，日本東京理化器械有限公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：722N型，上海菁華科技儀器有限公司。

阿里卻是拗住了，一定要扶羅爹爹，嘴上說(shuō)：“姆媽說(shuō)的。要攙羅爹爹。是姆媽說(shuō)的!”說(shuō)著，竟還有點(diǎn)眼淚汪汪。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助提取青岡櫟果殼多酚 青岡櫟果實(shí)曬干后取殼，粉碎，過(guò)60目篩，45 ℃恒溫箱中烘干至恒重。準(zhǔn)確稱取青岡櫟果殼粉末，按料液比1∶30(g/mL)加入40%的乙醇水溶液，超聲功率240 W，提取20 min，過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)提取2次，合并上清液，將上清液4 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，再將上清液反復(fù)抽濾至澄清透亮，得青岡櫟果殼多酚提取液。將多酚提取液于50 ℃下真空旋干，即得青岡櫟果殼多酚提取物(CGSE)。

1.3.2 多酚得率的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法并修改。準(zhǔn)確移取1 mL青岡櫟果殼多酚提取液，與1 mL Folin-Ciocalteau試劑充分混勻，反應(yīng)5 min，加入10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的碳酸鈉溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，用蒸餾水做對(duì)照，于765 nm處測(cè)定其吸光度，按式(1)計(jì)算青岡櫟果殼多酚得率。

(1)

式中：

R——多酚得率，%；

V——提取液體積，mL；

C——提取液中多酚濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率的影響：固定提取時(shí)間20 min，料液比1∶30(g/mL)，提取次數(shù)3次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%，20%，30%，40%，50%，60%，80%，95%)對(duì)多酚得率的影響。

(2)提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，料液比1∶30(g/mL)，提取次數(shù)3次，考察提取時(shí)間(5，10，15，20，25，30 min)對(duì)多酚得率的影響。

(3)料液比對(duì)多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取時(shí)間20 min，提取次數(shù)3次，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(g/mL)]對(duì)多酚得率的影響。

(4)提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，提取時(shí)間20 min，料液比1∶30(g/mL)，考察提取次數(shù)(1，2，3，4，5，6次)對(duì)多酚得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)四因素三水平中心組合試驗(yàn)。利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

1.3.5 青岡櫟果殼提取物鐵還原能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]的方法并稍作改進(jìn)。準(zhǔn)確移取20 μL CGSE溶液與300 μL FRAP工作液于96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min，測(cè)定593 nm處的吸光值，以不同濃度的FeSO4代替樣品進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以VC、BHT為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 青岡櫟果殼提取物氧自由基吸收能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]的方法并稍作改進(jìn)，準(zhǔn)確吸取25 μL CGSE溶液與150 μL熒光素鈉(FL)稀釋液至96孔熒光板中，振搖5 min，于37 ℃恒溫箱中溫育15 min，加入25 μL AAPH溶液，然后采用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm，測(cè)定間隔1.5 min。繪制熒光衰變曲線并計(jì)算其曲線面積。以VC、BHT為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用軟件SPSS 22.0和Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚得率影響較大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，多酚得率最高，說(shuō)明此時(shí)溶劑的極性與青岡櫟果殼中酚類物質(zhì)的極性較為接近，有助于活性物質(zhì)的溶出。乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，溶劑極性差異增大，會(huì)使一些醇溶型雜質(zhì)和大極性的成分溶出，導(dǎo)致得率下降[17]。料液比對(duì)多酚得率的影響呈先增大后趨于平衡的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時(shí)，多酚得率最高，說(shuō)明在此比例下多酚溶出已趨于飽和，繼續(xù)增加溶劑會(huì)促進(jìn)其他物質(zhì)溶出，影響多酚類物質(zhì)的提取效果[18]。當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，多酚得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，部分多酚類物質(zhì)被輕度氧化或分解，多酚結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致其得率下降[19]。當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，多酚得率最高，繼續(xù)增加提取次數(shù)，長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用會(huì)使原料細(xì)胞破裂程度加大，增加雜質(zhì)溶出，甚至破壞酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[20]。

圖1 各因素對(duì)多酚得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素，以多酚得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)四因素三水平中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平表見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，并剔除方程中不顯著變量，得優(yōu)化后的回歸方程：

Y=3.06+0.002 5A+0.036 2B+0.012 5C+0.042 5D+ 0.027 5AC-0.140 0AD+0.122 5BC-0.115 0BD-0.072 5CD-0.135 8A2-0.090 8B2-0.119 6C2-0.157 1D2。

(2)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析 由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用影響不顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)，提取時(shí)間與料液比，提取次數(shù)與提取時(shí)間的交互作用影響顯著，與回歸方程分析結(jié)果一致。利用已建立的數(shù)學(xué)模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)優(yōu)化出最優(yōu)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間25 min、料液比1∶40(g/mL)、提取次數(shù)5次，此條件下的青岡櫟果殼多酚得率為3.13%(n=3)，與理論預(yù)測(cè)值3.08%相差較小，說(shuō)明該模型可行，優(yōu)化結(jié)果可靠。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)?

圖2 各因素對(duì)總酚得率的交互作用

2.3 青岡櫟果殼提取物的體外抗氧化能力

2.3.1 鐵還原能力 由圖3可知，CGSE的FRAP值為(984.44±123.15)mg FeSO4/g·DW，低于VC的，但高于BHT的，表明CGSE具有較好的鐵還原能力。

圖3 CGSE、VC與BHT的FRAP值

2.3.2 氧自由基吸收能力 由圖4可知，CGSE的ORAC值為(200.15±23.24)mg Trolox/g·DW，低于VC的，但顯著高于BHT的，表明CGSE能較好的抑制活性氧自由基對(duì)熒光物質(zhì)的淬滅。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助溶劑提取青岡櫟果殼多酚，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出CGSE的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間25 min、料液比1∶40(g/mL)、提取次數(shù)5次，此條件下的多酚得率最高為3.13%，顯著高于張俞等[21]的結(jié)論。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，CGSE具有較好的鐵還原能力，同時(shí)能很好地抑制活性氧自由基對(duì)熒光物質(zhì)的淬滅。雖然CGSE的鐵還原能力和氧自由基吸收能力弱于商業(yè)常用抗氧化劑VC，但均顯著高于BHT，表明CGSE具有較好的體外抗氧化能力，可作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑植物資源。試驗(yàn)未對(duì)青岡櫟果殼多酚的其他功能活性和作用機(jī)制進(jìn)行深入探究，后續(xù)可對(duì)其細(xì)胞和體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行研究并探討其作用機(jī)制，同時(shí)評(píng)估其他方面的功能活性。

圖4 CGSE、VC與BHT的ORAC值