李 達(dá) 李曉科 - 張 濤 許仁杰 - 袁 鵬 李 超

(1.紅云紅河煙草〔集團〕有限責(zé)任公司，云南 昆明 650231；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650024)

卷煙的香氣成分主要通過各種樣品前處理方法與氣相色譜—質(zhì)譜相結(jié)合的方法檢測。煙絲香氣的揮發(fā)性成分都是依附于煙絲基質(zhì)存在的，所以避免基質(zhì)干擾，提高檢測限，需對樣品進(jìn)行前處理。目前，樣品前處理方法應(yīng)用比較多的主要為頂空法和萃取法[1]。頂空法又分為動態(tài)頂空法(HD)[2]和靜態(tài)頂空法(HS)[3]，用于定性分析低沸點、強揮發(fā)性成分，可避免溶劑萃取法中溶劑污染問題，并具有成本低、無環(huán)境污染等優(yōu)點。萃取法分為蒸餾萃取、溶劑萃取、超臨界萃取和固相微萃取(SPME)等。其中，蒸餾萃取、溶劑萃取[4]均存在萃取溶劑污染問題，而且會對痕量分析(樣品中待測組分含量低于10-6的分析方法)產(chǎn)生干擾。超臨界萃取需要超臨界流體作為萃取劑，萃取過程對設(shè)備要求較高[5]。SPME屬于非溶劑型選擇性萃取法，有效避免了痕量分析中溶劑污染問題，但早期存在靈敏度不夠高和回收率很低的問題[6]。有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)在此基礎(chǔ)上給攪拌棒套上聚二甲基硅氧烷橡膠管，可以得到很高的測定靈敏度和回收率，該方法即攪拌棒固相微萃取(SBSE)。SBSE自發(fā)現(xiàn)以來，因其具有不需要有機溶劑、測試簡便、富集倍數(shù)高等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留及揮發(fā)性成分的富集收集[8-10]。劉汗青等[11]應(yīng)用固相微萃取—熱解吸系統(tǒng)—氣相色譜—質(zhì)譜(SBSE-TDS-GC-MS)處理并測定了煙草中表香揮發(fā)性成分。該方法需要加入蒸餾水、加熱、不斷攪拌及去除基體效應(yīng)的相關(guān)操作，操作相對較為繁瑣。

為避免基體效應(yīng)同時簡化試驗操作步驟，試驗擬在SBSE-TDS-GC-MS基礎(chǔ)上引入靜態(tài)頂空萃取模式，將HS-SBSE用于煙絲樣品前處理萃取，通過熱解析方式解析，再經(jīng)氣相色譜—質(zhì)譜檢測，以期建立一種操作簡單，靈敏度高和回收率高測定卷煙香氣揮發(fā)性成分的方法。并將該方法應(yīng)用于加香工藝中的參數(shù)優(yōu)化，為探求和完善香煙嗅感和加香工藝的選擇提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料及試劑

材料：同一主力品牌規(guī)格M的中國市售卷煙成品煙絲樣品，不同加香工藝下煙絲樣品，A集團工藝質(zhì)量部；

萘內(nèi)標(biāo)：美國Sigma公司；

乙酸丙酯、丙二醇甲醚、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、2-乙基己基乙酸酯、乙酸、長葉烯、丙二醇、戊二酸二甲酯、芐醇、2.6-二叔丁基對甲酚、3-乙酰基吡咯11種卷煙揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

固態(tài)萃取攪拌棒：Gerstel Twister攪拌棒(長20 mm，厚0.5 mm)，德國Gerstel公司；

氣相色譜柱：HP-INNOWAX型(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)，美國安捷倫科技公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：PerkinElmer Clarus 600型，美國PerkinElmer公司；

熱脫附儀：PerkinElmer Turbo Matrix300型，美國PerkinElmer公司；

分析天平：CP225D型，德國Sartorius公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇 由于研究對象具有揮發(fā)性，采用外標(biāo)法定量誤差較大，因此選擇內(nèi)標(biāo)法定量，并以香精香料檢測常用的低毒萘作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量[12]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取5.00 g萘，置于50 mL容量瓶中，用無水乙醚稀釋并定容，配制質(zhì)量濃度為100.0 g/L的內(nèi)標(biāo)儲備液；移取0.100 mL內(nèi)標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中，用無水乙醚稀釋并定容，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。上述所有溶液均于4 ℃冰箱中保存，使用前恢復(fù)至室溫。

1.2.3 樣品前處理 攪拌棒在使用前放入TDS熱脫附管中老化。在室溫下，精確稱取煙絲樣品90.0 g，置于小燒杯中，并加入0.4 mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液萘，之后立即取一個杯內(nèi)底固定有固態(tài)萃取攪拌棒(通過大燒杯外的磁鐵進(jìn)行固定)的大燒杯倒扣在裝有煙絲的小燒杯上，并進(jìn)行密封，吸附時間為120 min。相對于傳統(tǒng)的攪拌手段，該法能有效避免成品煙絲在傳統(tǒng)高速攪拌下的破壁效應(yīng)，使萃取到的揮發(fā)性成分更準(zhǔn)確。其中，為了確定最佳煙絲量，分別取4種煙絲樣品30.0，50.0，70.0，90.0和110.0 g按1.2.2、1.2.4和1.2.5的試驗條件，通過檢測11種目標(biāo)物含量，最終得到最優(yōu)試驗條件；為了確定最佳吸附時間，分別取4種吸附時間60，80，100，120，140 min按1.2.2、1.2.4和1.2.5的試驗條件，通過檢測11種目標(biāo)物含量最高的2-乙基己基乙酸酯含量，最終得到最優(yōu)試驗條件。

1.2.4 熱脫附操作條件 吸附結(jié)束后，將固態(tài)萃取攪拌棒放入玻璃脫附管中部，以便使其均勻加熱，進(jìn)而達(dá)到樣品完全解吸。樣品脫附管溫度180 ℃，冷阱捕集溫度-20 ℃，熱解吸溫度260 ℃，閥溫度190 ℃，傳輸線溫度200 ℃，脫附時間3 min，進(jìn)口分流流速10 mL/min，出口分流流速10 mL/min。其中，為了確定熱脫附操作條件最優(yōu)條件，選用L9(34)表對進(jìn)熱解吸溫度、樣口冷聚焦溫度和解吸時間進(jìn)行正交分析，通過檢測11種目標(biāo)物含量最高的2-乙基己基乙酸酯含量，最終得到最優(yōu)試驗條件。

1.2.5 氣相色譜—質(zhì)譜檢測條件

(1)氣相色譜條件：采用HP-INNOWAX氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流進(jìn)樣，載氣為氦氣(99.99%)，流速1 mL/min，程序升溫為50 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min。

(2)質(zhì)譜條件：EI+離子源；電壓70 eV；離子源溫度180 ℃,傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲5 min。

1.2.6 定性分析 利用GC-MS聯(lián)機，將作為檢測器的質(zhì)譜和氣相色譜聯(lián)用，將未知物的圖譜與NIST Library相比較，選取匹配度>85%的作為初步鑒定結(jié)果，之后分別通過https://webbook.nist.gov/chemistry/搜索初步鑒定結(jié)果的科瓦茨保留指數(shù)，與計算結(jié)果相比較，最終確定成分。

1.2.7 定量分析 由于揮發(fā)性組分的含量與其色譜峰面積呈正比，所以可以通過內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量、內(nèi)標(biāo)色譜峰面積和被測組分的色譜峰面積，得到被測組分質(zhì)量，實現(xiàn)定量分析。并按式(1)計算揮發(fā)性組分的含量。

(1)

式中：

Xn——第n種揮發(fā)性組分的含量，μg/g；

Mi——加入的內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，μg；

An——第n種揮發(fā)性組分的色譜峰面積；

Ai——內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積；

m——試驗稱取的煙絲或煙末的質(zhì)量，g。

1.2.8 樣品的感官評價 分別取8種工藝條件下生產(chǎn)的30個卷煙樣品，將卷煙樣品在恒溫恒濕箱中平衡48 h。由A集團工藝質(zhì)量部，組織持有相關(guān)證件的評吸人員8名，根據(jù)GB 5606.4—2005對8組正交試驗樣品進(jìn)行感官評吸中的香氣進(jìn)行評價。

1.2.9 科瓦茨保留指數(shù)(KI值)測定 取正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品按1.2.2、1.2.4和1.2.5的試驗條件分析，記錄每個正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間，采用保留指數(shù)的線性升溫公式[式(2)]計算各揮發(fā)性組分的KI值。

(2)

式中：

KI——科瓦茨保留指數(shù)；

n——正構(gòu)烷烴碳原子個數(shù)；

tx——被分析組分流出峰的保留時間，min；

tn——碳原子為n的正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品流出峰的保留時間，min；

tn+1——碳原子為n+1的正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品流出峰的保留時間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷煙香氣組分的定性和定量分析

在同樣的色譜條件下，以萘為內(nèi)標(biāo)，對分離得到11種揮發(fā)性組分進(jìn)行分析，色譜圖見圖1。綜合考慮出峰時間、定性和定量特征離子、響應(yīng)強弱等因素，對11種化合物成分進(jìn)行定性分析，并結(jié)合1.2.7的定量計算公式得到卷煙香氣組分內(nèi)標(biāo)法相對定量結(jié)果，見表1。從表1可以看出，樣品含有大量的酯類和酸類化合物，同時還含有少量醚類和酮類化合物，這些化合物都是特征香氣的物質(zhì)，能部分反映該煙絲的香氣特點。

2.2 前處理參數(shù)的選擇

2.2.1 樣品量的選擇 4種煙絲樣品30.0，50.0，70.0，90.0和110.0 g下11種目標(biāo)物的檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品量≥70.0 g時才能同時檢出11種目標(biāo)物。樣品量為110.0 g時，基質(zhì)效應(yīng)較大，2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、3-乙?；量?、2-乙基己基乙酸酯等目標(biāo)物的測定含量反而有所降低，當(dāng)樣品量達(dá)到90.0 g時，不僅能同時檢出11種目標(biāo)物，基質(zhì)效應(yīng)較小，而且相比于樣品量70.0 g時所測定的目標(biāo)物含量高，峰形對稱，適合定量分析。綜合考慮，選擇樣品量為90.0 g作為最優(yōu)條件。

圖1 云煙某品牌卷煙主流煙氣成分色譜圖

表1 云煙某品牌中部分香氣組分內(nèi)標(biāo)法相對定量結(jié)果

2.2.2 平衡時間的選擇 由表2可知，2-乙基己基乙酸酯的含量為11種目標(biāo)物中最高，為了更便捷實現(xiàn)對前處理參數(shù)的合理優(yōu)化，只對2-乙基己基乙酸酯進(jìn)行分析。在1.2.2、1.2.4和1.2.5的最優(yōu)試驗條件下，考察了不同平衡時間下2-乙基己基乙酸酯峰的強度變化。平衡時間為60，80，100，120，140 min下的2-乙基己基乙酸酯峰強度，見圖2。從圖2可知，隨著平衡時間的增加，2-乙基己基乙酸酯峰強度呈現(xiàn)先增加后幾乎不變的規(guī)律。平衡時間為140 min下的2-乙基己基乙酸酯峰強度與120 min下的乙基己基乙酸酯峰強度幾乎不變，因此，選擇120 min的平衡時間為最優(yōu)條件。

圖2 不同平衡時間下2-乙基己基乙酸酯的峰強度

Figure 2 Peak intensity of 2-ethylhexyl acetate at different equilibrium times

2.3 熱脫附操作條件的優(yōu)化

進(jìn)熱解吸溫度、樣口冷聚焦溫度和解吸時間是影響萃取棒上所吸附的樣品能否實現(xiàn)完全解吸和試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。根據(jù)以往試驗經(jīng)驗和相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，確定正交優(yōu)化試驗因素及水平取值見表3。以2-乙基己基乙酸酯峰的強度為被測物質(zhì)，選用L9(34)表進(jìn)行優(yōu)化試驗。

表3 正交優(yōu)化試驗因素及水平取值

Table 3 Factors and levels of orthogonal optimization test

水平A樣口冷聚焦溫度/℃B進(jìn)熱解吸溫度/℃C解吸時間/min1-3024022-2026033-102804

表4 正交優(yōu)化試驗方案及結(jié)果

從表4可知，冷聚焦溫度對試驗結(jié)果影響最大，其次為熱解吸溫度和解吸時間，最佳工藝組合為A2B2C2，即在260 ℃下，脫附3 min、-20 ℃的冷聚焦溫度為最優(yōu)熱脫附操作條件。在最佳工藝參數(shù)，2-乙基己基乙酸酯峰的強度達(dá)到最大值，為104 098。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限 采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，以各目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，各目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。在基體中進(jìn)行添加回收試驗，在優(yōu)化的試驗條件下，分別按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)計算11種目標(biāo)物的檢出限(LOD)及定量限(LOQ)。結(jié)果表明，11種化合物的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限和定量下限分別為0.052 7～0.524，0.172～1.684 μg/g。各組分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限如表5所示。

表5 方法評價結(jié)果

2.4.2 回收率與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，選取6個樣品作為空白樣品，在高、中、低3種不同濃度水平(2.5，20.0，37.5 μg/mL)上，重復(fù)進(jìn)行6次加標(biāo)回收率試驗，回收率和精密度試驗結(jié)果見表6。結(jié)果表明，11種目標(biāo)產(chǎn)物平均加標(biāo)回收率在85.2%～97.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～6.0%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足定量分析的要求。

表6 回收率與精密度結(jié)果?

? 丙二醇甲醚、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、2-乙基己基乙酸酯、芐醇、2,6-二叔丁基對甲酚、3-乙?；量┑母?、中、低3種濃度分別為2.5，20.0，37.5 μg/mL。乙酸丙酯、乙酸、長葉烯、丙二醇和戊二酸二甲酯的高、中、低3種濃度分別設(shè)定為0.125，0.750，1.500 μg/mL。

2.4.3 方法的重現(xiàn)性 為了考察方法的重現(xiàn)性，分別稱量同一樣品相同質(zhì)量12份，在上述確定的優(yōu)化試驗條件下進(jìn)行測定，結(jié)果如表7所示。試驗結(jié)果表明，11個組分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)最大的是丙二醇，為10.3%；最小的是3-乙酰基吡咯，為3.5%。平均值為5.6%，說明該試驗方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.5 卷煙加香工藝參數(shù)的優(yōu)化

加香工藝參數(shù)主要有滾筒頻率和風(fēng)門大小，在確保含水率在符合工藝要求的情況下，以揮發(fā)性成分總量為指標(biāo)，每個因素設(shè)置4個水平，制定出試驗設(shè)計表如表8所示，結(jié)果如表10所示。

由表9可知，當(dāng)滾筒頻率為40 r/min，風(fēng)門大小為90%時，揮發(fā)性成分總量最大。其中乙酸丙酯、2-甲基丁酸-3-甲基丁酯、2-乙基己基乙酸酯、戊二酸二甲酯等酯類均達(dá)到最大值。這些成分能夠增加卷煙香氣，減少抽吸時的刺激性和干燥感，對卷煙質(zhì)量有重要影響。酸類如可以調(diào)節(jié)煙草酸堿度調(diào)和煙草香味的乙酸，也是在滾筒頻率為40 r/min，風(fēng)門大小為90%時含量達(dá)到最大值，達(dá)到0.526 μg/g。值的注意的是，在試驗序號1和2中，即滾筒頻率為30 r/min，風(fēng)門大小為85%和95%時，丙二醇含量低于檢測值，未檢出。推測原因為：滾筒頻率為30 r/min時，煙絲存在相互疊加或結(jié)塊現(xiàn)象，存在不均勻和蓬松度不夠，進(jìn)而導(dǎo)致加香不均勻，可能部分煙絲加香量較少，導(dǎo)致未檢出。結(jié)合表8可知：當(dāng)滾筒頻率>40 r/min之后，所有揮發(fā)性成分均下降。其原因可能是，滾筒轉(zhuǎn)動頻率較高時，駐留時間不夠，導(dǎo)致某些成分無法長時間駐留在煙絲上。風(fēng)門大小過大或者過小均不利于揮發(fā)性成分總量。可能風(fēng)門大小過小，排潮能力降低，含水率上升，香味可能不容易透發(fā)。風(fēng)門大小過大，含水率過低，后續(xù)工藝過程可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的散失。因此，綜合考慮各種因素，滾筒頻率40 r/min，風(fēng)門大小為90%時為最優(yōu)加香工藝參數(shù)。

表7 重現(xiàn)試驗結(jié)果

表8 試驗設(shè)計表

表9 試驗結(jié)果

為了使檢測數(shù)據(jù)與感官評吸結(jié)果進(jìn)行對比，由A集團工藝質(zhì)量部，組織持有相關(guān)證件的評吸人員8名，根據(jù)GB 5606.4—2005對8組樣品進(jìn)行感官評吸。發(fā)現(xiàn)同樣是滾筒頻率為40 r/min，風(fēng)門大小為90%時，其香氣得分最高。因此HS-SBSE-TD-GC-MS法可以作為檢測卷煙香氣的有力技術(shù)手段。

3 結(jié)論

試驗建立了一種運用頂空—攪拌棒固相微萃取—熱脫附—氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定卷煙香氣中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測方法，該方法相對已有文獻(xiàn)[5-6,11]報道的方法具有操作簡便、靈敏度高、線性關(guān)系好，并有效避免了基體效應(yīng)、痕量分析中溶劑污染問題等優(yōu)點，且能用于卷煙香氣中11種揮發(fā)性物質(zhì)的檢測，在此基礎(chǔ)上研究并優(yōu)化了加香工藝參數(shù)，確定了最優(yōu)加香工藝參數(shù)為滾筒頻率40 r/min，風(fēng)門大小為90%。在今后的研究中可以拓寬該檢測方法的使用范圍，對卷煙其他工藝過程進(jìn)行分析，以期為確定其他卷煙生產(chǎn)的最佳工藝參數(shù)提供參考。