徐群英 - 翟羽恒 -

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

交鏈孢霉菌(Alternaria species)在自然界中普遍存在，營寄生或腐生生活，在低溫下生長繁殖，具有植物致病性[1]。交鏈孢霉菌能產(chǎn)生70多種真菌毒素和植物毒素，統(tǒng)稱為交鏈孢毒素。研究[2]表明，人及動物食用被交鏈孢毒素污染的谷物及飼料會面臨急性和慢性毒性、致畸和致癌性、發(fā)育和生殖毒性等風(fēng)險。交鏈孢酚單甲醚(alternariolmethyl ether，AME)是其中一種主要的、毒性較強的交鏈孢霉菌代謝產(chǎn)物，屬于二苯-α-吡喃酮類化合物，也是谷物及其產(chǎn)品中檢出率較高的一種交鏈孢毒素[3]。

小麥?zhǔn)侵袊匾Z食作物之一，在一些地區(qū)由于收獲、加工和貯藏方法不當(dāng)，小麥交鏈孢毒素檢出率較高，嚴(yán)重影響人畜健康[4-6]。謝莉等[7]對在河南省部分地區(qū)銷售的95份小麥粉樣品進行交鏈孢毒素檢測，發(fā)現(xiàn)AME檢出率高達98.0%，平均含量為0.0～94.1 μg/kg。目前有關(guān)谷物中交鏈孢毒素降解和消除技術(shù)的研究較少[8]，且谷物中交鏈孢毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)檢測方法尚未頒布。

目前，定量檢測交鏈孢毒素的方法主要有薄層色譜法(TLC)[9]、氣相色譜法(GC)[10]、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[11]、液相色譜法(LC)[5, 12-13]、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)[14-16]和酶聯(lián)免疫法(ELISA)[17]等。其中，高效液相色譜法(HPLC)是應(yīng)用最廣的檢測交鏈孢毒素的方法，該方法準(zhǔn)確性高、分析速度快[18-19]，而檢測交鏈孢霉毒素的液相色譜法主要選用熒光檢測器和紫外檢測器[4, 12]。試驗擬通過考察檢測器種類和小麥樣品前處理條件對AME的分離和檢測效果，以期建立一種檢測效果好、準(zhǔn)確性強、耗時短、高效的小麥中AME定量分析方法，為國標(biāo)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

小麥：市售；

甲醇、乙腈：美國 Fisher Scientific公司；

AME標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，美國Supelco公司；

固相萃取小柱：Bond Elut Plexa，200 mg，6 mL，美國Agilent公司；

色譜柱：ZORBAX SB-aq，150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，美國Agilent公司；

氮氣、氧氣(純度≥99.8%)：無錫新南化學(xué)氣體有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超純水儀：Simplicity UV型，電阻≥18.2 MΩ/cm，美國Millipore公司；

高效液相色譜儀：1260系列，帶紫外(VWD)和熒光檢測器(FLD)，美國 Agilent公司；

真空萃取裝置：Vac Elut 12，美國Agilent公司；

氮吹儀：DCY-12G型，青島?？苾x器股份有限公司；

分析天平：BSA124S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

振蕩器：VORTEX 1型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 AME標(biāo)準(zhǔn)儲備液和工作液的配制 將AME標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙腈溶液，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃貯藏。臨用前，取適量AME標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入相應(yīng)的流動相，配制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃貯藏。

1.2.2 液相色譜檢測條件優(yōu)化

(1)HPLC-FLD液相條件：參考陳月萌等[12]的方法略作修改，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min。

(2)HPLC-VWD液相條件：進樣量10 μL，柱溫40 ℃，流動相采用甲醇和1%磷酸水溶液梯度洗脫。0～15 min，55%甲醇，流速0.7 mL /min；15～18 min，55%～65%甲醇，保持3 min，流速1.0 mL/min；然后將甲醇濃度恢復(fù)至55%，流速0.7 mL/min，并維持1 min。紫外檢測器波長256 nm。

1.2.3 樣品提取條件的優(yōu)化 未污染的小麥經(jīng)磨粉過0.18 mm孔徑篩后，稱取250 g小麥粉，加入AME標(biāo)準(zhǔn)工作液，使加標(biāo)后的樣品中AME濃度為400 μg/kg，室溫放置過夜后待測。分別稱取9份25 g加標(biāo)小麥粉于150 mL錐形瓶中，加入100 mL溶劑(乙腈/甲醇/水，45/10/45，體積比，pH 3)，分別于20，30，40 ℃下提取30，45，60 min，取上層提取液過濾待用。

1.2.4 樣品凈化 將Bond Elut Plexa固相萃取小柱依次用甲醇和水活化，取5 mL樣品提取液過柱上樣，然后用5 mL H2O淋洗，3 kPa真空干燥2 min。用5 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮吹儀吹至近干，將固體粉末用流動相復(fù)溶。制樣時溶液過0.22 μm有機針孔濾膜，濾液供液相色譜儀檢測分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。單因素方差分析組間差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC條件優(yōu)化

由圖1可知，AME在FLD中出峰時間為7.6 min，與陳月萌等[12]的研究結(jié)果相似；在VWD中出峰時間為22.5 min，Pavón等[20]使用VWD檢測AME的檢出時間為15.6 min，加標(biāo)回收率為93.6%～101.3%，檢出時間和加標(biāo)回收效果較優(yōu)于試驗結(jié)果，可能是由于其使用了粒徑更小的色譜柱，使得AME與雜質(zhì)的分離效果有較大的提高。AME標(biāo)品在FLD中雖然出峰時間較短但檢測信號較低，綜合選取VWD及其相應(yīng)的色譜條件進行AME檢測。

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

由表1可知，采用乙腈/甲醇/水(45/10/45，體積比)作為提取溶劑，當(dāng)提取溫度為30 ℃，振蕩30 min時，AME回收率最高，達90.60%。

2.3 方法驗證

由圖2可知，AME檢測具有良好的線性，R2為0.999 5，線性范圍為0.25～2.00 μg/mL，AME的檢出限(S/N=3)為2.52 μg/kg，定量限(S/N=10)為8.40 μg/kg。

圖1 AME標(biāo)準(zhǔn)品的檢測色譜圖

表1 加標(biāo)小麥樣品中AME的提取效果?

? 小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 AME檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表2可知，AME回收率為80.1%～88.3%，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為2.13%～6.59%，3.57～8.43%。試驗方法對加標(biāo)小麥中AME檢測具有良好的回收率和精密度，故此法的重現(xiàn)性好，相對穩(wěn)定，可用于小麥中AME的檢測。

3 結(jié)論

當(dāng)使用VWD檢測器，提取溫度30 ℃，提取時間30 min時，污染AME的小麥樣品經(jīng)HPLC檢測效果最佳。方法的檢出限為2.52 μg/kg，定量限為8.40 μg/kg，線性范圍為0.25～2.00 μg/mL，AME回收率為80.1%～88.3%，具有良好的日內(nèi)、日間精密度。后續(xù)可通過調(diào)節(jié)色譜分離柱等方式同時快速檢測小麥的主要幾種交鏈孢毒素。

表2 AME檢測的準(zhǔn)確度和精密度