李智琪 - 史 瑛 王萌萌 - 毛 健 張秀紅 -

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214000；3.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004)

大曲是白酒釀造的糖化發(fā)酵生香劑，除含有產(chǎn)生淀粉酶的霉菌、合成酒精的酵母菌外，還含有大量的細(xì)菌，如芽孢桿菌和乳酸菌等。酒醅發(fā)酵過(guò)程中，除兼性厭氧的酵母菌能快速生長(zhǎng)繁殖將還原糖轉(zhuǎn)化為酒精外，厭氧環(huán)境還促進(jìn)了耐氧乳酸菌的大量生長(zhǎng)。不同香型酒醅中均檢測(cè)出含有大量的乳酸菌，陳申習(xí)等[1]從清香型小曲酒機(jī)械化釀造車間發(fā)酵過(guò)程中的酒醅中分離得到51株乳酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA鑒定為5株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、10株短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、8株希式乳桿菌(Lactobacillushilgardii)、28株瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)。杜海等[2]從芝麻香型白酒酒醅中分離篩選出32株乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為7個(gè)種，分別為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、玉米乳桿菌(Lactobacilluszeae)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilacti)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceu)。乳酸菌在白酒釀造過(guò)程中起重要作用，一方面是乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸是白酒主要的風(fēng)味物質(zhì)，在白酒微量成分中占有很大比例，乳酸能起到調(diào)和酒味的作用，掩蓋酒精的刺激性，還能與多種成分相互親合，使酒體協(xié)調(diào)柔和，包括乳酸在內(nèi)的有機(jī)酸含量直接影響白酒的品質(zhì)[3]；另一方面是乳酸與乙醇酯化合成乳酸乙酯，與乙酸乙酯共同組成清香白酒的主體香氣成分[4]。但是，隨著氣溫的回升，酒醅乳酸菌過(guò)量生長(zhǎng)，酒醅酸度過(guò)高，產(chǎn)酒量降低，同時(shí)乳酸乙酯隨之升高，影響了基酒質(zhì)量[5]。目前，酒醅乳酸菌的生長(zhǎng)控制仍缺乏有效手段。

乳酸菌在一定條件下能釋放自溶酶水解細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)胞裂解自溶。不同乳酸菌菌株自溶度不同，影響自溶度的因素也較多[6]。關(guān)于乳酸菌自溶度的研究主要集中于發(fā)酵乳制品發(fā)酵劑乳酸菌的研究[7-8]。長(zhǎng)期厭氧高酸、高醇釀酒環(huán)境對(duì)酒醅乳酸菌自溶度的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)擬從清香酒醅中分離乳酸菌，考察其自溶特性，為白酒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

清香型酒醅：某清香型白酒企業(yè)；

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、磷酸氫二鉀2 g、酵母粉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、吐溫80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g，碳酸鈣15 g，121 ℃滅菌20 min，青島海博生物技術(shù)有限公司；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麥芽浸粉：生物試劑，青島海博生物技術(shù)有限公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

PCR反應(yīng)試劑、DNA Marker：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：5810R型，德國(guó)Eppendorf公司；

雙光速紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：A560型，翱藝儀器(上海)有限公司；

PCR儀：ProFlexTMBase型，賽默飛科技有限公司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

電子分析天平：FA2004N型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：YHZ-98AB型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

凝膠成像儀：Universal Hood II型，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 清香酒醅乳酸菌的分離純化 取酸度分別為1.54，1.25，1.16，0.90 mmol/10 g的酒醅各25 g溶解于225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻，兩層無(wú)菌紗布過(guò)濾。無(wú)菌條件下用無(wú)菌生理鹽水稀釋成濃度為10-1～10-77個(gè)梯度的樣液，每個(gè)梯度3個(gè)平行，選取10-5，10-6，10-7稀釋度的稀釋液1 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基澆注，凝固后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取平板上有明顯溶鈣圈的單菌落進(jìn)行多次劃線、分離純化。并將得到的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和過(guò)氧化氫試驗(yàn)，選擇革蘭氏染色陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶陰性的菌株初步判斷為乳酸菌[9-12]。并用甘油管冷凍保藏法-80 ℃保藏備用。

1.2.2 清香酒醅乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定 使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法對(duì)菌株基因組DNA進(jìn)行提取[13-14]。16S rDNA擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用引物：正向引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板1 μL，補(bǔ)充去離子水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，16 ℃保溫。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，取PCR產(chǎn)物與6×Loading Buffer混合，加樣于1.0%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，上機(jī)電泳，電泳液為1×TBE，溴化乙錠(EB)染色30 min，電泳結(jié)束后將膠板置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若PCR擴(kuò)增成功，則會(huì)在1 500 bp處見(jiàn)到條帶并拍照，送至上海生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

乳酸菌16S rDNA序列分析：將測(cè)序得到的乳酸菌16S rDNA序列在NCBI上遞交Blast進(jìn)行同源性分析，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與待分析序列相近的公開(kāi)發(fā)表菌株的16S rDNA序列[15-16]。

1.2.3 乳酸菌自溶度檢測(cè)

(1)菌體培養(yǎng)及處理：活化后菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD650 nm為0.9～1.0)后，以4%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至目標(biāo)菌體濃度，于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，收集菌體。無(wú)菌水洗滌兩次菌體，然后用PBS(50 mmol/L，pH 6.5)緩沖液重懸，備用。調(diào)整菌液吸光值OD650 nm為1.0左右。

(2)自溶度檢測(cè)方法：將收集的待測(cè)菌體細(xì)胞懸浮，收集菌體于PBS(50 mmol/L，pH 6.5)緩沖液中，調(diào)整菌液吸光值OD650 nm為1.0左右。測(cè)定初始OD650 nm。其余上述菌懸液置于培養(yǎng)箱溫育24 h，測(cè)定OD650 nm。按式(1)計(jì)算菌株自溶度[17]。

(1)

式中：

R——自溶度，%；

A0——初始OD650 nm值；

At——24 h后測(cè)定的OD650 nm值。

1.2.4 溫度對(duì)菌株自溶度的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體細(xì)胞，重懸于pH 6.5的PBS緩沖液(50 mmol/L)中，分別置于15，20，25，50 ℃下溫育24 h，測(cè)定其自溶度。

1.2.5 pH對(duì)菌株自溶度的影響 洗滌菌體分別重懸于pH為3.5，4.0，4.5，5.0的PBS緩沖液(50 mmol/L)中，于37 ℃溫育24 h，測(cè)定其自溶度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，運(yùn)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒酒醅乳酸菌的分離、純化

用MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基從清香酒醅中分離純化出47個(gè)單菌株，菌落呈圓形，直徑為0.5～3.0 mm，米黃色或白色，不透明或半透明，表面濕潤(rùn)光滑，凸起，革蘭氏染色陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)生孢子，過(guò)氧化氫酶陰性，可初步確定為乳酸菌。部分菌株的菌落特征及顯微特征見(jiàn)圖1、2。

圖1 部分乳酸菌菌株的菌落特征

圖2 部分乳酸菌菌株顯微特征

2.2 清香型白酒酒醅乳酸菌菌株的16S rDNA鑒定

由表1可知，與短乳桿菌屬(L.brevis)親緣關(guān)系最近的菌株有SL61-1、SL61、SL21、YP49-1、YP62、MC50、SL31、YP37-1、SL63、LMM40、LMM87-1、YP38-1、MC90、YP31-1、MC55-1、SL33-1、YP49、YP37-2、MC46、MC46-2；與布氏乳桿菌屬(L.buchneri)親緣關(guān)系最近的菌株有SL45、SL58、SL63-2、SL28、YP15-2、SL7-1、YP8；與植物乳桿菌屬(L.plantarum)親緣關(guān)系最近的菌株為YP15-1、SL18、YP37、SL18、YP37、LMM23、MC30-2、SL25-1、MC50-1、YP82-3、SL58-1、SL63-1、LB36、LMM3-3、LB60、LB1-1、MC29、LMM3-5；與戊糖乳桿菌屬(L.pentosus)親緣關(guān)系最近的菌株有YP24、LB27、SL33、SL44-1。

表1 47株乳酸菌 16S rDNA 序列 Blast 比對(duì)結(jié)果

2.3 清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶度

張玉玉等[18]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體的自溶度最高，因此試驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體測(cè)定自溶度。由表2可知，MC46株、MC30-2株的自溶度最高，分別達(dá)29.27%，26.62%；SL58株、LMM40株、YP82-3株、YP62株的自溶度最低。L.brevis中，除自溶度最高的L.brevisMC46外，L.brevisLMM40的自溶度僅為5.03%；L.buchneriSL7-1的自溶度達(dá)17.29%，L.buchneriYP15-2和L.buchneriSL45的自溶度分別為10.78%，10.51%，L.buchneriSL58的自溶度為5.01%，與張玉玉等[18]的結(jié)果類似。

表2 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期菌株的自溶度

2.4 溫度對(duì)清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影響

由圖3可知，大部分菌株15 ℃時(shí)的自溶度最低，隨溫度的升高自溶度增大，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，自溶度達(dá)到最高。而菌株L.brevisMC46-2在30 ℃時(shí)的自溶度最大，達(dá)29.18%；菌株L.plantarumMC30-2在低溫環(huán)境下也表現(xiàn)出較高的自溶度，從25 ℃升溫至37 ℃時(shí)，自溶度增幅僅為1.66%。

圖3 溫度對(duì)乳酸菌自溶度的影響

圖4 pH對(duì)乳酸菌自溶度的影響

2.5 pH對(duì)清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影響

由圖4可知，菌體自溶與環(huán)境pH值密切相關(guān)。當(dāng)pH為3.5時(shí)，各菌株自溶度僅為2.65%～6.96%；當(dāng)pH為3.5～6.5時(shí)，菌株的自溶度隨pH的增大而增大；當(dāng)pH為6.5時(shí)，各菌株的自溶度增加到20.97%～29.27%。而菌株L.brevisYP49-1在較低的pH下表現(xiàn)出活躍的自溶狀態(tài)，與Riepe等[19]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，從清香型白酒——汾酒酒醅中篩選出的47株乳酸菌經(jīng)形態(tài)及16S rDNA分子生物學(xué)鑒定為20株短乳桿菌(L.brevis)、7株布氏乳桿菌(L.buchneri)、16株植物乳桿菌株(L.plantarum)和4株戊糖乳桿菌(L.pentosus)。采用比濁法對(duì)4個(gè)屬的乳酸菌菌株自溶能力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株自溶度與菌種沒(méi)有明顯的相關(guān)性，表現(xiàn)出菌株特異性。在白酒釀造的溫度范圍內(nèi)(約15～35 ℃)，大多數(shù)菌株的自溶度隨溫度的升高而增加；在酒醅發(fā)酵的pH范圍內(nèi)(3.5～6.5)，大多數(shù)菌株的自溶度隨pH的升高而增大。試驗(yàn)初步了解了清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶特性，但自溶過(guò)程中起主要作用的關(guān)鍵自溶酶和其自溶機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。