邢宏博， 張薄博*， 許贛榮， 劉仁春， 張 耀， 江 云， 張大永

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 江蘇無錫214122；2. 四川新荷花中藥飲片股份有限公司 四川 成都610036）

紅曲作為一種藥食兩用絲狀真菌，在我國有著悠久的歷史。 東漢王粲的《七釋》中已有瓜州紅曲的記載[1]，本草綱目、本草從新及食用本草等均對紅曲菌的藥用價值進(jìn)行介紹，這可能與紅曲米發(fā)酵產(chǎn)生的中的活性物質(zhì)有著一定關(guān)系[2]。

降脂紅曲是紅曲中藥飲片中應(yīng)用最廣的品種之一。 由于Monacolin K（MK）的結(jié)構(gòu)與合成膽固醇的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-COA）結(jié)構(gòu)相似，故MK 能夠競爭性抑制膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶HMG-CoA 還原酶，從而可以有效地降低人體中膽固醇的合成量[3]。

目前對于紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的研究，主要集中于通過優(yōu)化碳源、氮源、無機(jī)鹽等手段來提高M(jìn)K 的產(chǎn)量[4]，但此法不太適用于紅曲中藥飲片類紅曲的生產(chǎn)。 作者從紅曲菌株篩選、生產(chǎn)原料選擇、基質(zhì)加水量等基本條件進(jìn)行研究，在單因素基礎(chǔ)上用Design-Expert 8.0 對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵的水分、 變溫時間和接種體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，以提高M(jìn)K 的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 紅曲菌株

作者所在實驗室保存菌株紅色紅曲菌（9901，9909）、叢毛紅曲菌9908，紫色紅曲（W1，ZH2，ZH6及SJS-6）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：200 g 土豆，加水煮沸，過濾，定容至1 L。加20 g 葡萄糖，20 g 瓊脂。115 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基： 葡萄糖60 g/L， 蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，玉米漿6 g/L。 121 ℃滅菌20 min.

1.3 發(fā)酵方法與操作

1.3.1 孢子懸浮液制備 用無菌水將菌種孢子從斜面洗脫下來，制成孢子濃度為1×106個/mL 的孢子懸液，用于接種。

1.3.2 液態(tài)種子培養(yǎng) 上述孢子懸液按一定的比例接種到裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 的三角瓶中，在30 ℃、170 r/min 的旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)48 h。1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)的液態(tài)種子按一定比例（最佳為10%）接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，并放于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 MK 檢測方法

按照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2847-2007 功能性紅曲米（粉）的方法進(jìn)行測定[5]。

1.5 紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 工藝優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，選取加水體積分?jǐn)?shù)（A）、變溫時間（B）和接種體積分?jǐn)?shù)（C） 3 個因素為自變量，以MK 的產(chǎn)量為因變量， 利用Design-Expe 設(shè)計三因素三水平實驗，響應(yīng)面實驗的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平設(shè)計Table 1 Response surface experimental factor level design

1.6 直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測方法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 15683-2008 大米直鏈淀粉的測定進(jìn)行測定[6]。

1.7 大米糊化特性檢測方法

浸泡大米，膠體磨粉碎離心，用0.2 mol/L 的NaOH浸泡，過篩除雜質(zhì)并用雙蒸水洗滌。 用0.1 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH，雙蒸水洗滌后于35 ℃烘干，用RVA4500檢測[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 紅曲菌株篩選

不同紅曲菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的能力不同，故對實驗室保藏的 7 株紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的能力進(jìn)行檢測，篩選出高產(chǎn)MK 的菌株，結(jié)果見圖1。

圖1 7 株紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的對比Fig. 1 Comparison of MK production by SSF of different Monascus strains

從圖1 可知，所選菌株中最適合生產(chǎn)MK 的菌株為紅色紅曲菌9901，其次為紅色紅曲菌9909。 目前降脂紅曲的生產(chǎn)菌種要求是紫色紅曲菌，但所選的4 株紫色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 能力較弱。 實驗結(jié)果表明，紅色紅曲菌也可以高產(chǎn)MK。從降脂功能性來看，僅以紫色紅曲菌作為生產(chǎn)菌種的合理性就值得商榷了[8]。 另外，國內(nèi)功能性紅曲米（粉）的輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2847-2007 中規(guī)定所用菌種為紅色紅曲霉（Monascus anka Nakazawaet Sato），跟我們的實驗結(jié)果較為相符[5]。 作者綜合考慮，選擇紅色紅曲菌9901 作為后續(xù)實驗所用菌株。

2.2 紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 基質(zhì)選擇

傳統(tǒng)紅曲米均是以大米作為原料。 但大米種類繁多，不同品系、不同產(chǎn)地的大米存在一定差異。 因此選用6 種常見大米作為紅曲菌發(fā)酵基質(zhì)，考察不同大米對紅曲菌產(chǎn)MK 的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同大米對紅色紅曲菌9901 產(chǎn)MK 的影響Fig.2 Effect of different solid substrates on the production of MK of Monascus ruber 9901

從圖2 可知，在所選的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的產(chǎn)量最高的基質(zhì)為廣西早秈米，其MK 產(chǎn)量可達(dá)7 017.00 mg/kg。 以江蘇新米作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)時， 紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中MK 產(chǎn)量僅有1 011.33 mg/kg。 用廣西早秈米作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)時MK 產(chǎn)量為以江蘇粳米作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)時MK 產(chǎn)量的6.94 倍。

可見， 不同大米作為發(fā)酵基質(zhì)對紅色紅曲菌9901 產(chǎn)固態(tài)發(fā)酵MK 有較大影響。為了研究不同大米作為基質(zhì)時MK 產(chǎn)量差異的原因， 我們測定了6種大米的糊化特性及其直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 見圖3及表2。 結(jié)果表明，6 種大米的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和峰值粘度差異較大。 大米中的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)及峰值粘度與大米的粘度之間有緊密聯(lián)系，直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，峰值粘度值越大，粘性越差[9]。 秈米的峰值粘度及直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于粳米，其中廣西早秈米的峰值粘度和直連淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高， 分別為2 972 cp 和27.5%， 且其粘度相對較小。 這與實驗中觀察到的現(xiàn)象一致，因此，選用直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和峰值粘度相對較高的廣西早秈米作為基質(zhì)時， 有利于紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)MK。

圖3 不同大米糊化特性曲線Fig. 3 Curve of gelatinization characteristics of different rice

表2 不同大米直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Amylose content of different rice

2.3 發(fā)酵時間對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響

紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的發(fā)酵周期較長，不同菌株、不同培養(yǎng)方式紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的周期不同[10-11]，因此有必要研究紅色紅曲菌9901 的最適發(fā)酵周期，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacoln K、Monacoln K 收率及產(chǎn)品收率的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on MK production of Monascus ruber 9901

從圖4 可以看出， 從第4 天到第16 天底物消耗較快，可能是由于菌體快速生長及次級代謝產(chǎn)物大量生產(chǎn)所造成的。 從第8 天到第18 天MK 的產(chǎn)量及收率迅速增加，MK 大量積累， 發(fā)酵20 d 時MK 的產(chǎn)量及收率都達(dá)到最大。而到了20 d 后MK 的產(chǎn)量及收率都稍微有所下降，可能是產(chǎn)物有所分解造成的。 因此，紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的發(fā)酵周期為20 d。

2.4 抖料次數(shù)對紅色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響

在瓶式發(fā)酵過程中，物料易結(jié)塊，抖料是將塊狀物料拍散成顆粒狀的過程。 作者對是否抖料及抖料次數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果見圖5。

圖5 抖料次數(shù)對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響Fig. 5 Effect of shaking times on MK production in SSF of Monascus ruber 9901

從圖5 可知，抖料次數(shù)對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 有著較大影響。 抖料頻率過高或不抖料均不利MK 的生產(chǎn)，可能是由于抖料次數(shù)過多對菌絲造成較大損傷，不抖料則會有結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，不利于基質(zhì)利用造成的。當(dāng)僅抖料一次時紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的產(chǎn)量達(dá)到最高。 因此，僅抖料一次最有利于紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK。

2.5 不同加水量對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在40%~60%之間[12]，水分過高過低均不利于紅曲菌生長。 分別向固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中添加30、35、40、45、50 mL 水，研究加水量對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同加水量對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響Fig. 6 Effect of different water addition on MK production of Monascus ruber 9901

從圖6 可以看出，隨著加水量的增加，紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的產(chǎn)量先增加后減少。當(dāng)加水量為45 mL 時，發(fā)酵產(chǎn)物中MK 產(chǎn)量達(dá)到最高。 當(dāng)加水量為30 mL 時，發(fā)酵結(jié)束后米粒質(zhì)地較硬，斷層稍有白色，可能是由于基質(zhì)未被水滲透，從而菌體不易生長到米粒內(nèi)部。 當(dāng)加水量為50 mL時，發(fā)酵基質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。而加水量為45 mL時，結(jié)團(tuán)現(xiàn)象并不明顯。 因此，加45 mL 水最有利于紅色紅曲菌9901 的生長及MK 的合成。

2.6 接種體積分?jǐn)?shù)對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響

接種體積分?jǐn)?shù)直接影響菌體生長進(jìn)而影響次級代謝產(chǎn)物的合成，因此研究了不同接種體積分?jǐn)?shù)對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 接種體積分?jǐn)?shù)對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響Fig. 7 Effect of inoculation amount on production of MK by SSF of Monascus ruber 9901

從圖7 可以看出，隨接種體積分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中MK 產(chǎn)量先升高后降低。這是因為接種體積分?jǐn)?shù)太少菌體生長較慢，但過大的接種體積分?jǐn)?shù)會使菌體生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗，同樣不利于MK的合成。當(dāng)接種體積分?jǐn)?shù)為10%時，發(fā)酵產(chǎn)物中MK產(chǎn)量最高。 因此10%的接種體積分?jǐn)?shù)為紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的最適接種體積分?jǐn)?shù)。

2.7 不同變溫方式對紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的影響

關(guān)于紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)MK 的研究大都采用變溫培養(yǎng)，但不同菌株變溫方式不同[4，10]。因此，作者采用先30 ℃或32 ℃培養(yǎng)然后變溫到25 ℃培養(yǎng)，從而確定紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的最佳培養(yǎng)方案。

圖8 不同變溫方式對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響Fig. 8 Effect of different temperature on MK production by Monascus ruber 9901

從圖8 可以看出，在所選的條件中，最適合紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的培養(yǎng)條件為：30 ℃培養(yǎng)2 d，變溫到25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 d。30 ℃及32 ℃培養(yǎng)時紅曲菌體生長較快，營養(yǎng)物消耗也快。 但由于紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 發(fā)酵周期為20 d，如果在30 ℃或32 ℃培養(yǎng)過久， 可能到了后期生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物時營養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)消耗殆盡。 故30 ℃培養(yǎng)2 d，變溫到25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 d 為紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的最適條件。

2.8 紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計原理和單因素試驗的結(jié)果，選取加水量、變溫時間及接種量作為自變量，設(shè)計了3 因素3 水平的響應(yīng)面分析實驗。 以MK 產(chǎn)量作為考核指標(biāo)進(jìn)行實驗，相關(guān)的設(shè)計與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

采用Design-Expert 8.0.1 對實驗結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，得到紅色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的回歸方程為：Y=10 197.90+559.76A+740.17B+381.51C-1 009.50AB-904.90AC-494.65BC-2 098.48A2-1 336.09B2-2 576.32C2。 回歸模型分析見表4。 模型P值小于0.01 說明該模型極顯著； 失擬項為0.267 9， 大于0.05，說明回歸方程沒有失擬，所以該模型可信度較高。 因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著R2Adj=0.987 6，模型調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.971 8，說明該模型與實驗擬合良好，該回歸方程能夠用來描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表4 回歸模型分析結(jié)果Table 4 Regression model analysis results

如圖9 所示，從3D 響應(yīng)面圖可以看出曲面最高點均在響應(yīng)面上，故各因素最優(yōu)水平在所選范圍之內(nèi)。 各因素對紅色紅曲菌9901 影響越大，其3D響應(yīng)面圖越為陡峭。 從以上結(jié)果可以看出A（加水量）、B（30 ℃培養(yǎng)時間）對紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 影響較大。 結(jié)合表4 可以看出，三者的交互作用AB＞AC＞BC。

用Design-Expert 以MK 產(chǎn)量最高為目標(biāo)， 對模型進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)加水量為45.33 mL，30 ℃培養(yǎng)53.86 h，接種體積分?jǐn)?shù)為10.19%時， 紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中MK 產(chǎn)量為10 314.4 mg/kg。 為了方便生產(chǎn)，以初始水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%左右的廣西早秈米作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，加水量為45 mL，接種體積分?jǐn)?shù)10%，先于30 ℃培養(yǎng)50 h，然后變溫到25 ℃培養(yǎng)至20 d，在此條件下MK 產(chǎn)量達(dá)到10 453.07 mg/kg，與模型預(yù)測結(jié)果差異不大，說明該模型預(yù)測值與實驗值具有良好的擬合性。

圖9 響應(yīng)面3D 圖及平面圖Fig. 9 Response 3D surface and contour

3 結(jié) 語

通過對實驗室保藏的7 株紅曲菌進(jìn)行篩選，從中篩選出一株高產(chǎn)MK 的紅色紅曲菌9901，通過不同谷物基質(zhì)篩選，最終選擇了粘性較小的廣西早秈米作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。用Box-Behnken Design 對紅色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵的加水量、 接種體積分?jǐn)?shù)及30 ℃培養(yǎng)時間進(jìn)行優(yōu)化，從而確定色紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的最佳發(fā)酵條件為： 加水量45 mL，30 ℃培養(yǎng)50 h，然后變溫到25 ℃培養(yǎng)20 d，接種體積分?jǐn)?shù)為10 %。 在不添加無機(jī)鹽及額外碳源、氮源的條件下，紅色紅曲菌9901 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的產(chǎn)量可達(dá)10 453.07 mg/kg。