陳 托， 張立杰， 張麗君， 榮詩闊， 王 振， 彭根遠， 鞏發(fā)海， 李 海

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004；3.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院兗州院區(qū)呼吸內(nèi)科，濟寧 272000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。在我國，結(jié)直腸癌居全國惡性腫瘤發(fā)病的第四位，并呈逐年上升的趨勢[1-2]。Piezo2 基因家族可通過機械信號轉(zhuǎn)導過程激活下游信號轉(zhuǎn)導途徑，在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[3]，推測Piezo2 可能參與了結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移。本實驗通過實時熒光定量PCR（q-PCR）及免疫組織化學染色方法檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中Piezo2 的mRNA 和蛋白的表達，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，以探討Piezo2 在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標本來源于2015 年10 月至2017 年3 月在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院行結(jié)直腸外科手術(shù)的結(jié)直腸癌患者113 例，術(shù)后均經(jīng)病理科確診。獲取結(jié)直腸癌標本113 份，同時取該標本相對應的癌旁組織（距離癌組織中心＞5 cm）。所有患者術(shù)前均未進行放療、化療，年齡32～78 歲，平均（53.00±12.27）歲；男64 例，女49 例；直腸癌62 例，結(jié)腸癌51 例。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol（Invitrogen，貨號：15596-026）、反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（Thermo Fisher，貨號：00118088）、SYBRRSelect Master Mix（Thermo Fisher，貨號：4472908）；鼠抗人Piezo2 多克隆抗體（abcam，貨號ab81327）、超敏二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號：P6001）、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋，貨號：ZL1-9018）；Bio-rad IQ5 儀器等。

1.3 方法

1.3.1 q-PCR 實驗 研磨結(jié)直腸癌及癌旁組織后加入Trizol 裂解液充分裂解，氯仿分離RNA，等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，棄上清液，75%乙醇清洗RNA 沉淀，混勻后離心，加入適量DEPC 水溶解沉淀。然后酶標儀檢測260 nm 和280 nm 處的OD 值，測定RNA 溶液濃度和純度。20 μL 體系加樣后在Bio-Rad 儀器上上機檢測（50℃預熱2 min，95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火及延伸1 min，共40 個循環(huán)）。其中Piezo2 引物：上游5'CGGAATTCATGGCCTCAGAAGTGGTGTGC 3'；下游5'CGGGATCCT CAATTTGTTTTTTCTCTAGTCCATTTGATCATTGT CTCT3' ；內(nèi)參GADPH 引物：5'ACATCAAGAAGG TGGTGAAGCAG3'，5' GTCAAAGGTGGAGGAGTG GGT3'。

1.3.2 免疫組織化學法（IHC） 石蠟包埋固定，切片，烤片3 h 脫蠟、脫水，檸檬酸鹽高壓修復后3% H2O2室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，10%正常山羊血清封閉后滴加一抗Piezo2（1：300）工作液，4℃下孵育過夜，抗鼠二抗孵育1 h，蘇木素染色、鹽酸酒精分化、清水反藍，脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，于Leica 正置顯微鏡下觀察并拍照，使用GraphPad 6.0 軟件統(tǒng)計作圖。

1.4 判定標準

1.4.1 q-PCR 法結(jié)果判定 采用2-△△Ct分析Ct值計算結(jié)果：△△Ct=癌組（Ct-Ct 空白）-癌旁組（Ct-Ct 空白）。

1.4.2 IHC 法結(jié)果判定[4]直腸癌組織中Piezo2主要表達在細胞膜上，由病理科醫(yī)師在100 倍鏡下隨機觀察10 個視野，根據(jù)著色強度和陽性細胞數(shù)分別計分。染色強度：陰性（-）：無染色，0分；弱（+）：淡黃色，1 分；中（++）：棕黃色，2 分；強（+++）：棕褐色，3 分。IHC 染色后細胞數(shù)評分標準：染色細胞數(shù)占同類型細胞數(shù)的百分比＜30%為1 分，30%～60%為2 分，＞60%為3 分。著色強度和陽性細胞數(shù)計分之和≥4 分視為Piezo2蛋白表達陽性；＜4 分為Piezo2 蛋白表達陰性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中Piezo2 mRNA 表達情況

癌組織中Piezo2mRNA 相對表達倍數(shù)高于癌旁組織（P＜0.01），見圖1。

2.2 結(jié)直腸癌和癌旁組織中Piezo2 蛋白表達情況

IHC 實驗結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Piezo2主要表達在細胞膜上，染色為棕褐色，呈強陽性表達；在癌旁組織中，Piezo2 呈弱陽性或陰性表達。Piezo2 在結(jié)直腸癌組織的陽性表達率（68.14%）高于癌旁組織（16.81%）（P＜0.01），見圖2。

2.3 不同臨床特征結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達比較

結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達率隨分化程度增高而降低（P＜0.01），TNM 分期為（玉+Ⅱ）期的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達率低于（Ⅲ+Ⅳ）期者（P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01）；不同年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小、部位的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見表1。

表1 不同臨床特征的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達比較

3 討論

Piezo 蛋白是一類機械敏感性離子通道，包括Piezo1 和Piezo2[5-6]，是通過感受細胞膜表面應力變化，實現(xiàn)胞外機械信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導的通道[7-9]。體內(nèi)研究表明，當上皮細胞變得過于擁擠時，激活Piezo1 通道以擠壓觸發(fā)細胞[10]，直至細胞死亡，以保持屏障功能并防止腫瘤形成[11]。同時還發(fā)現(xiàn)Piezo1 可以提供機械力和細胞內(nèi)生化途徑激活之間的聯(lián)系結(jié)合促進胃癌的轉(zhuǎn)移[12]，亦可促成膀胱癌的癌變[13]。Piezo 作為直接機械活化的離子通道，在癌癥發(fā)展中將腫瘤微環(huán)境的機械特性緊密地聯(lián)系在一起。

Piezo2 蛋白是一類復雜的跨膜蛋白[8]，其在腸上皮細胞的功能中發(fā)揮作用[14]。研究證實，Piezo2 可作為重要的機械力傳感器感受機械刺激并將其轉(zhuǎn)化為電信號，參與輕觸覺、本體感覺、機械性痛覺超敏、血管內(nèi)皮細胞的重排和血管發(fā)育[3，9，14-18]。然而，Piezo2 在機械刺激下可誘發(fā)Ca2+內(nèi)流而激活下游信號通路，通過一系列的復雜信號級聯(lián)反應來促進腫瘤血管的生成，并加快細胞遷移及腫瘤發(fā)展，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，引起如細胞增殖、血管通透性增加、血管生成、肌動蛋白重組以及遷移等反應[3，19]。同時，Piezo2 在多種疾病中如結(jié)腸炎、乳腺癌、喉鱗狀細胞癌、胃癌、膀胱癌、膠質(zhì)瘤等均高表

達[3，13，19-22]。

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Piezo2 mRNA 及蛋白的陽性表達率均高于癌旁組織，表明Piezo2 在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起著重要作用。為了進一步證實Piezo2 在結(jié)直腸癌中的作用，通過分析不同臨床特征結(jié)直腸癌組織中Piezo2 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)不同分化程度的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 的陽性表達率隨分化程度增高而降低，且TNM 分期（玉+Ⅱ）期的Piezo2 陽性表達率低于（Ⅲ+Ⅳ）期。同時，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中Piezo2 陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Piezo2 蛋白表達與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上，Piezo2 蛋白參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，此研究可能為結(jié)直腸癌患者分子水平治療提供新的思路與靶點，其具體機制及臨床應用有待進一步研究。