李曉菡， 馬 芳， 張 旭， 納 莉， 田進海， 王立斌

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，生物芯片中心，銀川 750004）

乳腺癌（breast cancer）是一種女性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康[1]。目前臨床對乳腺癌的治療主要通過手術(shù)、放療、化療等方式，但患者生存率及預(yù)后效果難以保證[2]。乳腺癌生物標(biāo)志物的檢測對輔助臨床診斷和預(yù)后判斷具有重要意義，目前臨床常用糖類抗原153（carbohydrate antigen 15-3，CA153）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為乳腺癌診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的生物標(biāo)志物。CEA 對乳腺癌的診斷敏感性為40%，CA153 對早期乳腺癌的敏感性為60%，晚期敏感性為80%。CA153 在乳腺癌術(shù)前檢測的總陽性率約為27.5%～65.9%，轉(zhuǎn)移性乳腺癌的陽性率約為80%[3-4]。雖然CEA 及CA153 檢測對乳腺癌臨床診斷具有指導(dǎo)意義，但因其靈敏度低、特異度不強等原因，限制了它們的診斷價值。篩選乳腺癌的新的分子標(biāo)志物，對乳腺腫瘤早期篩查及預(yù)后治療具有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共價鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA 分子[5]。circRNA廣泛存在于不同物種中，不僅在生物體內(nèi)含量豐富，而且具有組織特異性，在組織、血液和外泌體中都有穩(wěn)定表達。circRNA 能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管形成、代謝以及耐藥等功能來參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，這使得circRNA 成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后追蹤的理想生物標(biāo)志物[6]。Xuan 等[7]通過對喉鱗狀細(xì)胞癌組織芯片分析，發(fā)現(xiàn)有698 個circRNAs 下調(diào)，其中hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 與 腫 瘤T3-4 階段和分化不良有關(guān)，認(rèn)為hsa_circRNA_100855 和hsa_circRNA_104912 可以作為診斷喉癌的潛在分子標(biāo)志物。Li 等[8]通過分析術(shù)前和術(shù)后胃癌患者的36 對血漿樣品，篩選并驗證了hsa_circ_002059 與胃癌發(fā)生的關(guān)系，明確hsa_circ_002059 可作為診斷胃癌穩(wěn)定分子標(biāo)志物。Coscujuela 等[9]發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7中有circRNA 的特異表達，并且這些差異表達的circRNA 可以作為區(qū)分Luminal 與其他乳腺腫瘤亞型的依據(jù)，表明circRNA 具備成為乳腺癌分子標(biāo)記物和藥物靶標(biāo)的潛力。

本研究通過人環(huán)狀RNA 表達譜芯片篩選乳腺癌癌旁組織與乳腺癌組織中差異表達的circRNA，經(jīng)過顯著性篩選、基因功能注釋、靶基因預(yù)測、生物學(xué)功能富集和排除，確定了hsa_circ_0005777 作為研究對象，進一步研究其在乳腺癌組織和患者血液中的表達情況，分析和評價hsa_circ_0005777 與乳腺癌臨床特征的相關(guān)性，探討其在乳腺癌臨床診斷中的價值，為明確hsa_circ_0005777 作為分子標(biāo)志物在乳腺癌診療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016 年10 月—2017 年3 月收住于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤外科的乳腺癌患者的術(shù)后癌組織和癌旁組織標(biāo)本23 對，血液樣本40 例，以40 例健康體檢人群血液樣本作為對照。研究過程獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或其家屬均簽署知情同意書?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）女性；（2）乳腺癌的病理診斷；（3）無既往癌癥病史；（4）無艾滋/艾滋病病毒感染；（5）接受乳房切除術(shù)；（6）患者術(shù)前均無放療或化療史；（7）無合并其他腫瘤；（8）臨床信息完整。

1.2 樣本及臨床信息采集

收集乳房切除術(shù)后乳腺癌病變和離腫瘤邊緣＞5 cm 處正常組織，置于液氮中，立即轉(zhuǎn)入實驗室提取RNA。收集所有患者基本信息、臨床特征、入院檢驗結(jié)果等，包括：（1）基本信息：患者的年齡、性別、住院號、手術(shù)時間和方式等，其中患者年齡34～67 歲，平均（50.9±8.1）歲；（2）患者病理診斷和分型；（3）患者的臨床特征：腫瘤大小、是否轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM 分期、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、原癌基因人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）、抗原Ki-67 等臨床指標(biāo)，依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會對惡性腫瘤分期系統(tǒng)的分類確定患者的腫瘤分期[10]；（4）血清檢驗結(jié)果：血常規(guī)、糖類抗原125（CA125）、CA153、糖類抗原199（CA199）、CEA 等腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)。

1.3 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

使用TRIzol 法（美國Thermo Fisher Scientifc 公司）從組織中提取總RNA，然后通過GoScript 反轉(zhuǎn)錄（RT）系統(tǒng)（美國Promega 公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用外周血液樣品的總RNA 快速提取試劑盒（中國Bioteke 公司）從血液中提取總RNA并通過GoScript 反轉(zhuǎn)錄（RT）系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為：1μL 總RNA（約500 ng），1μL random primer，10 μL ddH2O，2 μL dNTP，4 μL反轉(zhuǎn)錄buffer，1 μL RNA 酶抑制劑，1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，總體積20 μL；反應(yīng)條件為：25℃5 min；42℃60 min，70℃5 min。RNA 及cDNA 置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 circRNA 芯片分析

選取三對乳腺癌和癌旁組織樣品RNA，利用人circRNA 表達譜芯片（Human cirRNA array rersion2.0，北京博奧生物有限公司）檢測樣品中circRNA 表達情況，該芯片覆蓋162351 條已知circRNA 的探針。應(yīng)用Feature Extraction 軟件（北京博奧生物有限公司）提取芯片數(shù)據(jù)，Cluster 3.0 軟件進行聚類分析，GeneSpring13.0（安捷倫科技有限公司）分析差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）、熒光值等。初步過濾和質(zhì)控去除檢測結(jié)果中不達標(biāo)部分，剩余數(shù)據(jù)進行篩選，篩選條件：FC≥4，P＜0.05，熒光值≥100。

1.5 qRT-PCR 檢測hsa_circ_0005777 在乳腺癌組織及癌旁組織的水平表達差異

將提取好的乳腺癌組織和血液樣本的cDNA使用LightCycler480II 定量平臺（美國Roche 公司）以β-actin 為內(nèi)參進行實時熒光定量PCR 實驗（qRT-PCR）。hsa_circ_0005777 引物：Forward-CA TCTAAAGAAAAGAAGGTTGGTGA，Reverse-GGC TGGTAGTGGCAGTGATT；β-actin 引物： Forward-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC，Reverse-GGACTCCATGCCCAGGAAGGAA。反應(yīng)體系為：以2 μL cDNA 作為模板，分別加入上、下游引物各0.8 μL，6.4 μL ddH2O 和10 μL SYBR MIX，總體積20 μL；qRT-PCR 條件為：在95 ℃下初始變性步驟10 min；然后在95 ℃下進行40 個循環(huán)15 s，60℃30 s，95 ℃5s，65 ℃2 min，在0.11 ℃/s 下升溫至97 ℃以測量熒光信號。記錄hsa_circ_0005777 和β-actin 的循環(huán)閾值（Ct）值。通過2-ΔΔCt方法分析計算基因的相對表達量[11]。所有樣品進行3 次重復(fù)實驗。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗以及單因素方差分析；計數(shù)資料采用雙變量Spearman 相關(guān)性檢驗；對單項及聯(lián)合檢測結(jié)果作圖繪制成ROC 曲線，計算曲線下面積（AUC）。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中的circRNA 表達譜芯片分析

乳腺癌及癌旁組織間存在大量差異表達的circRNA（圖1A、B）。通過篩選，并進行腫瘤的相關(guān)性預(yù)測后，選擇在乳腺癌中顯著下調(diào)的hsa_circ_0005777 作為研究目標(biāo)，其序列具有特異性（圖1C）。

2.2 hsa_circ_0005777 在乳腺癌中的表達

通過qRT-PCR 測定hsa_circ_0005777 在23對乳腺癌組織及癌旁組織中的相對表達，驗證篩選結(jié)果。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌組織中表達下調(diào)（P＜0.01），下調(diào)倍數(shù)約為4.683 倍（圖2A）。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0005777 在23 對乳腺癌患者組織中的AUC 為0.983（P＜0.01），截斷值為12.07，靈敏度為95.7%，特異度為95.7%（圖2B）。hsa_circ_0005777 與CEA 協(xié)同診斷乳腺癌的AUC 為0.952（P＜0.05），截斷值為12.38，靈敏度為90.5%，特異度為100%（圖2C）。

2.3 hsa_circ_0005777 的表達與乳腺癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

hsa_circ_0005777 乳腺癌組織circRNA 檢測值在CEA、腫瘤是否轉(zhuǎn)移、PR、Ki-67、TNM 分期、臨床早晚分期等臨床指標(biāo)中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），在腫瘤大小、CA153、HER2、ER、AR、病理類型中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

2.4 hsa_circ_0005777 與乳腺癌中臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

hsa_circ_0005777 與CEA 表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.466，P=0.025）。

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同臨床病理指標(biāo)中的分布（±s）

表1 hsa_circ_0005777 在乳腺癌不同臨床病理指標(biāo)中的分布（±s）

注：CA153 陽性的界限值為25 U·mL-1；CEA 陽性的界限值為5.2 ng·mL-1

臨床病理指標(biāo) n 癌組織circRNA 檢測值 t/F 值 P 值CA153 1.103 0.282陽性 2 14.21000±1.11723陰性 21 13.40900±0.97378 CEA -2.388 0.026陽性 2 12.03500±1.05359陰性 21 13.61620±0.88625腫瘤大小/cm 0.689 0.499＜2 14 13.32640±0.76085≥2 9 13.71560±1.27620腫瘤是否轉(zhuǎn)移 2.813 0.010是12 13.96170±0.95665否11 12.95180±0.73924 HER2 -0.898 0.380陽性 13 13.31620±1.05563陰性 10 13.69000±0.89581 ER 0.330 0.745陽性 20 13.50550±1.04627陰性 3 13.30000±0.48754 PR 2.513 0.020陽性 13 13.88540±0.98872陰性 10 12.95000±0.72329 AR 0.433 0.670陽性 21 13.50670±1.01979陰性 2 13.18500±0.62933 Ki-67/% 2.845 0.010＜14 9 12.84440±1.05652≥14 14 13.88640±0.70747 TNM 分期 3.698 0.043 I 8 13.25250±0.67875 II 9 13.12110±0.99462 III 6 14.31670±0.94574臨床分期 -2.281 0.033早期（I-II） 17 13.25220±0.86368中晚期（III-IV） 6 14.29400±1.05555病理類型 1.272 0.302非浸潤性癌 4 12.77750±1.08312浸潤性特殊型癌 2 13.64060±0.92669浸潤性非特殊型癌 17 13.50500±1.30815

2.5 hsa_circ_0005777 作為乳腺癌分期分型的臨床標(biāo)志物研究

hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌Luminal 分型、HER2、ER、PR、AR 陽性以及乳腺癌早晚分期，AUC 分別為0.518、0.600、0.567、0.568、0.596、0.789（P＞0.05）（圖3A～F）；hsa_circ_0005777 診斷Ki-67 陽性率的靈敏度為85.7%，特異度為77.8%（AUC=0.817，P=0.012，截斷值=13.38）（圖3G）；hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌是否轉(zhuǎn)移的靈敏度為75.0%，特異度為81.8%（AUC=0.795，P=0.016，截斷值=13.54）（圖3H）。

2.6 hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者血液中的表達

通過qRT-PCR 法測定hsa_circ_0005777 在健康人群血液和乳腺癌患者血液中的表達。結(jié)果顯示，與健康人群相比，hsa_circ_0005777 在乳腺癌患者的外周血中表達下降（圖4A）?；赗OC曲線分析，hsa_circ_0005777 的AUC 為0.835（P＜0.01），截斷值為14.43，靈敏度為80.0%，特異度為72.5%（圖4B）。

3 討論

circRNAs 是一類特殊的非編碼RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)，不易被核酸外切酶降解，與線性RNA 相比能更穩(wěn)定地存在于生物體內(nèi)[12]。circRNA 不僅含量豐富，而且在不同組織及發(fā)育階段都有特異性表達，這使得circRNA 成為疾病診斷、治療和預(yù)后追蹤的理想生物標(biāo)志物[13]。研究證實，circRNAs 與不同腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)，在乳腺腫瘤研究中，Lü 等[14]報道hsa_circ_103110、hsa_circ_104689 和hsa_circ_104821 在乳腺癌組織中表達水平升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219 和hsa_circ_406697 在乳腺癌組織中低表達，說明在乳腺腫瘤發(fā)生過程中，存在差異性表達的circRNA。Nair 等[15]通過Circ-Seq 篩查乳腺癌和癌旁組織中circRNA 表達，發(fā)現(xiàn)雌激素受體陽性（ER+）亞型中的circRNA 數(shù)量與增殖基因的復(fù)發(fā)風(fēng)險評分呈負(fù)相關(guān)，提示circRNA 可能與乳腺細(xì)胞增殖復(fù)發(fā)有關(guān)。Yin 等[16]從5 例乳腺癌和配對的健康志愿者血漿樣本中篩選差異表達的circRNA，通過q-RT-PCR 驗證候選circRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785 與腫瘤患者TNM 分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且比其他circRNA 具有更好的診斷價值，由此確定血液hsa_circ_0001785可作為乳腺腫瘤患者診斷的潛在生物標(biāo)志物。

hsa_circ_0005777 定位于人類5 號染色體正義鏈73136304-73136585 區(qū)域，全長281bp，由ARHGEF28 基因外顯子（exon）11 區(qū)剪切環(huán)化而成。hsa_circ_0005777 最早由Jeck 等[17]在男性正常龜頭細(xì)胞（HS68）中發(fā)現(xiàn)，驗證其為環(huán)狀RNA，并且在體內(nèi)比相關(guān)的線性mRNA 更穩(wěn)定。研究表明，hsa_circ_0005777 的靶基因ARHGEF28（Rgnef）可以通過與黏著斑激酶的相互作用促進結(jié)腸腫瘤增殖，推測hsa_circ_0005777 可能與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[18]。但目前尚未見到有關(guān)hsa_circ_0005777 與乳腺腫瘤的文獻報道，本研究首次報道hsa_circ_0005777 與乳腺癌的臨床特征相關(guān)性及其臨床診斷價值。

本研究中，首先選取乳腺癌和癌旁組織進行circRNA 芯片分析，通過對芯片檢測結(jié)果的聚類分析及差異化篩選，并進行腫瘤的相關(guān)性預(yù)測后，選擇在乳腺癌組織中下調(diào)的hsa_circ_0005777作為研究目標(biāo)。擴大樣本量進行qRT-PCR 驗證結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，hsa_circ_0005777 在23對乳腺癌組織中表達下調(diào)。 hsa_circ_0005777 診斷乳腺癌早期診斷的靈敏度為95.7%，特異度為95.7%，AUC 為0.983，截斷值為12.07。乳腺癌患者中CEA 與CA153 的聯(lián)用可以增加監(jiān)測乳腺癌診斷的靈敏度[19]，而hsa_circ_0005777 與CEA 水平相關(guān)可說明其作為新的腫瘤標(biāo)志物的可能性，提高臨床檢出率。將hsa_circ_0005777 與CEA 進行協(xié)同ROC 曲線分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷能夠明顯提升診斷的特異度。因此，hsa_circ_0005777 與CEA 的聯(lián)合檢測可為乳腺癌的早期診斷及篩查提供更加可靠的依據(jù)，為乳腺癌患者贏得更多的生存機會。

本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005777 與CEA 呈負(fù)相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌轉(zhuǎn)移的診斷中具有一定的靈敏度和特異度。說明hsa_circ_0005777 對乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測意義，可避免影像學(xué)檢查可能出現(xiàn)的漏診情況，從而作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的輔助診斷指標(biāo)，這與Valenzuela等[20]報道結(jié)果一致，表明hsa_circ_0005777 與乳腺癌的擴散有密切關(guān)系。ER、PR 的檢測有利于治療方案的選擇，只有受體陽性才適合內(nèi)分泌治療，而hsa_circ_0005777 與PR 陽性水平相關(guān)，提示其可作為乳腺癌分型的輔助診斷。Ki-67 在靜息細(xì)胞中的缺失和分裂細(xì)胞中的廣泛存在使其成為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，與證實其與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)[21]。本研究通過ROC 曲線分析hsa_circ_0005777 與Ki-67 對乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移診斷的靈敏度和特異度，提示hsa_circ_0005777 可能與乳腺腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力密切相關(guān)，對乳腺癌的診斷及預(yù)后的判斷有著重要的參考價值。

綜上所述，hsa_circ_0005777 在乳腺腫瘤患者組織和血液中低表達，并與乳腺腫瘤病理分期、分型以及腫瘤增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性較大，可以作為評估乳腺腫瘤發(fā)生的一個潛在的生物標(biāo)志物。