徐曉瀅 樊艷 徐楊穎 周建新

[摘要]：本文在高效液相色譜法測定嘔吐毒素（DON）改進(jìn)的基礎(chǔ)上，研究了小麥籽粒中嘔吐毒素分布和臭氧處理對小麥中嘔吐毒素的降解。結(jié)果表明利用改進(jìn)的高效液相色譜法對樣品中嘔吐毒素測定，矯正曲線在0～5.0μg/ml，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 8，選擇三個不同水平的加標(biāo)回收試驗，回收率在85.0%～105%。嘔吐毒素主要存在于麩皮中，臭氧處理可以降解40%以上的嘔吐毒素。

[關(guān)鍵詞]小麥;嘔吐毒素;臭氧;高效液相色譜法

中圖分類號：TS211 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202002

真菌毒素是由各自所屬的真菌代謝生成的有機(jī)代謝物，廣泛分布在自然界中，對人類的食物和飼料造成了廣泛的污染，造成數(shù)以千萬計的經(jīng)濟(jì)損失。真菌毒素屬于天然化學(xué)污染物，目前，人們可以確定檢測的真菌毒素大概有300種，由350種真菌產(chǎn)生[1]。其中嘔吐毒素（學(xué)名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，簡稱DON）現(xiàn)在被認(rèn)為是世界上常見的危害物中最危險的類型之一，在鐮刀菌毒素之中，嘔吐毒素對谷物造成的污染率和污染水平是最高的[2]。世界上很多國家都通過法規(guī)或者標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定了嘔吐毒素在糧食及其制品中限量。因此，如何去除谷物（特別是小麥和玉米）中的DON毒素，以減少其進(jìn)入面制品甚至食物鏈的研究需求越來越迫切。嘔吐毒素降解的方法主要有物理、生物和化學(xué)方法。由于嘔吐毒素具有耐熱性，導(dǎo)致物理方法的適用性不強(qiáng)，且降解產(chǎn)物難以確定，也難以做出安全性評判;生物方法降解真菌毒素的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，具有高效性和專一性，但性價比較低且較難適用于固體。化學(xué)方法主要是通過強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或者強(qiáng)氧化劑對物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，致使毒素被降解[3]。近年來，臭氧被利用于減少糧食和食品中的真菌毒素如赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1的研究比較多，在實踐中也得到肯定[4-8]，對于臭氧降低小麥中嘔吐毒素的研究相對較少。臭氧自身具有很大優(yōu)勢：它可以迅速破壞有機(jī)物中的雙鍵;具有極強(qiáng)的滲透性;可以分解為氧氣，不會產(chǎn)生有毒殘留，對環(huán)境無不良影響[9]，所以研究臭氧降解小麥中的DON含量的工藝參數(shù)，對于確保食品安全，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 樣品

小麥樣品來自江蘇南通，2017年3月9日采樣。其中，樣品A嘔吐毒素污染程度高;樣品B嘔吐毒素污染程度低。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（2707-1525-2998）：美國Waters公司;Bond Elut Mycotoxin多功能凈化柱（12165001B）：美國Agilent公司;臭氧滅菌箱（JR-Y10）：南京金仁環(huán)?？萍加邢薰?旋轉(zhuǎn)式粉碎機(jī)（D-47055）：德國brabender公司;高速離心機(jī)（GL-21M）：上海耐圣卡蘭實業(yè)有限公司;渦旋振蕩器（QL-862）：Qilinbeier公司;氮吹儀（N- EVAPTM112）：美國Organomation Asso-ciates公司;Clover C18色譜柱（4.6mm×250mm）、填料（粒徑5μm）：美國Waters公司。

1.3 試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司;甲醇、乙腈（色譜純）：德國LiChrosolv公司。

1.4 嘔吐毒素的檢測方法研究

1.4.1 色譜條件

檢測波長：218nm;流動相：甲醇∶水（20∶80）;柱溫：35℃;流速：0.8mL/min;進(jìn)樣量：50μL;根據(jù)樣品的峰保留時間對樣品進(jìn)行定性，根據(jù)峰面積外標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量。

1.4.2 樣品制備

參照《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111-2016）[10]中的免疫親和層析凈化高效液相色譜法，并對試樣提取、凈化和洗脫等步驟進(jìn)行了改進(jìn)：稱取25g磨碎的小麥樣品于離心杯中，加入乙腈∶水=84∶16（V∶V）溶液100mL，手持離心杯在渦旋振蕩器上振蕩3min，經(jīng)高速離心機(jī)（10 000r/min）離心20min，準(zhǔn)確吸取上清液4mL，注入玻璃注射器中，連接空氣壓力泵，設(shè)置通過時間為5min，在壓力作用下使溶液快速通過多功能凈化柱，收集濾液。氮吹濾液至溶劑全部被吹干，然后使用乙腈∶水=20∶80（V∶V）溶液1mL復(fù)溶。將復(fù)溶溶液過0.22μm微孔濾膜，溶液收集于2mL樣品瓶中待高效液相色譜儀分析。

1.4.3 回收率測定

取陰性樣品的小麥磨碎，稱取25g至于離心杯中，共5份，分別向其中添加濃度為0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg的DON標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行處理與檢測，處理步驟同樣品制備。

1.4.4 預(yù)處理平行試驗

取小麥樣品中DON超標(biāo)的小麥芯粉樣品6份，進(jìn)行處理與檢測，處理步驟同樣品制備。

1.5 嘔吐毒素含量在小麥籽粒中的分布

小麥碾磨工藝按照我國農(nóng)業(yè)部頒布的《小麥實驗制粉 第1部分：設(shè)備、樣品制備和潤麥》（NY/T 1094.1-2006）[11]執(zhí)行。打開粉碎機(jī)，使其正反空轉(zhuǎn)各5min，直至到收集倉中不再出現(xiàn)粉末。打開轉(zhuǎn)向旋鈕，從入口處緩慢投入過篩后的小麥樣品100g，碾磨結(jié)束后，兩個收集倉分別有麩皮和芯粉，將其分開取出存放。之后采取上述除盡粉末殘留的方法反復(fù)收集，使樣品充分碾磨。

1.6 臭氧處理對小麥中嘔吐毒素含量的影響

1.6.1 臭氧處理時間對小麥中嘔吐毒素含量的影響

小麥樣品A 5份，將臭氧處理時間分別設(shè)置為30min、60min、90min、120min、150min，處理濃度10g/h取出，按2.4方法測定嘔吐毒素含量。

1.6.2 臭氧處理濃度對小麥中嘔吐毒素含量的影響

小麥樣品A 4份，將臭氧濃度分別設(shè)置為2.5g/h、5g/h、7.5g/h和10g/h，處理時間90min后取出，按2.4方法測定嘔吐毒素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素的方法2.1.1 校正曲線及回歸方程

將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL，有低到高濃度依次進(jìn)樣檢測，得到如圖1所示的嘔吐毒素校正曲線，相關(guān)系數(shù)0.999 871，回歸方程為Y=7.579 58×104-3.094 061 ×103。嘔吐毒素的標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖2所示。

2.1.2 加標(biāo)回收實驗

分別做500μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg三個添加水平的回收試驗，結(jié)果如表1所示。

2.1.3 預(yù)處理平行實驗

樣品A的芯粉樣品，進(jìn)行從預(yù)處理開始的5次重復(fù)試驗，其實驗結(jié)果數(shù)據(jù)如表2所示。

2.1.4 精密度實驗

對于同一個經(jīng)過預(yù)處理的小麥樣品，在高效液相色譜中重復(fù)進(jìn)樣6次，可得到含量數(shù)據(jù)如表3所示。

由上述實驗可知，在0～5.0μg/ml時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，不同水平的回收率在85.0%～105%，預(yù)處理平行實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.37%，多次進(jìn)樣精密度實驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%。該方法準(zhǔn)確可靠，簡便易行。

2.2 小麥籽粒中嘔吐毒素的分布情況

碾磨100g小麥，稱量得到的麩皮和芯粉的重量。其中麩皮約25g，占比25%;芯粉約70g，占比70%，其余為損耗。測定結(jié)果如表4所示。對于DON污染程度高的樣品A，全麥粉中嘔吐毒素含量為4 590μg/kg，是國家標(biāo)準(zhǔn)限量4.5倍（限量1 000μg/kg），麩皮中的嘔吐毒素含量是芯粉中的2倍。對于DON污染程度低的樣品B，所有的DON都集中分布于麩皮中，芯粉中不含有DON。

2.3 臭氧處理對小麥中嘔吐毒素含量的影響

2.3.1 臭氧處理時間對小麥中嘔吐毒素的影響

將樣品A分別在相同臭氧濃度（10g/h）處理不同時間后取出，碾磨，對DON含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。由表5可知，小麥籽粒中的DON都因為臭氧處理而降低，且降解率與處理時間呈正相關(guān)。

2.3.2 臭氧處理濃度對小麥中嘔吐毒素的影響

將小麥樣品分別置于5個濃度梯度的臭氧環(huán)境中90min，然后測得其中的DON含量如表6所示。由DON的變化趨勢圖可以看出，相同處理時間內(nèi)，當(dāng)改變臭氧濃度對小麥進(jìn)行講解處理。在濃度小于7.5g/h時，小麥全麥粉中中DON的含量也會逐漸下降，且降低速率逐漸減小，濃度為7.5g/h時，降解率為41.18%，繼續(xù)提高臭氧濃度，DON的降解率的變化則在3%左右，下降效果不明顯。麩皮與芯粉的變化趨勢與小麥粉相同。所以，當(dāng)臭氧處理小麥的時間為90min的時候，臭氧降解DON的濃度可選擇7.5g/h。

3 結(jié) 論

本方法與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111-2016）相比，在試驗提取、凈化和洗脫方面，本實驗采用均質(zhì)并離心后提取上清液的方式，對嘔吐毒素進(jìn)行溶解，利用多功能凈化柱對其進(jìn)行凈化。由精密度檢測結(jié)果可知平行實驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.37%，儀器精密度測試相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%，方法具有可行性。

DON在麩皮中的含量都要高于在芯粉中的含量，主要分布在麩皮中，通過去皮，可去除部分嘔吐毒素。

隨著臭氧處理濃度的提高和時間的延長，小麥籽粒中DON降解率逐漸提高，臭氧處理濃度7.5g/h和時間為90min時，降解率可達(dá)到45%。

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[11] NY/T 1094.1-2006，小麥實驗制粉 第1部分：設(shè)備、樣品制備和潤麥[S].

收稿日期：2019-12-23

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）;江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目（TAPP）。

作者簡介：徐曉瀅，女，博士，研究方向為食品化學(xué)。

通信作者：周建新，男，碩士，研究方向為糧油儲藏。