張 艷，付 巖，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

恩拉霉素(Enramycin)是1966年由日本武田藥品研究所發(fā)現(xiàn)的一株殺真菌素鏈霉菌(StreptomycesfungicidicusNo.B5477)經(jīng)發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于多肽類抗生素。恩拉霉素的主要成分有恩拉霉素A和恩拉霉素B，此外還有少量的恩拉霉素C和恩拉霉素D[1]。動(dòng)物使用后，能改善腸道內(nèi)的細(xì)菌群，可促進(jìn)豬、雞增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，且具有低毒、低殘留特性，2005年在國(guó)內(nèi)開始獲批生產(chǎn)使用[1]。該藥物是少數(shù)幾種可用于飼料添加的抗生素之一，但生產(chǎn)中為追求效益往往超量使用，一方面損傷動(dòng)物的臟器組織[2]，另一方面勢(shì)必造成其在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留量增加。目前我國(guó)GB 31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》和原農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告均未規(guī)定恩拉霉素在動(dòng)物可食性組織中的最大殘留量(MRL)[3-4]，但日本規(guī)定了恩拉霉素在豬、雞的可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)中的MRL為30 μg/kg[5]。為保障我國(guó)動(dòng)物性食品安全和促進(jìn)國(guó)際貿(mào)易，迫切需要建立快速準(zhǔn)確的動(dòng)物性食品中恩拉霉素的檢測(cè)方法。

目前已建立的生物材料中恩拉霉素的分析方法相對(duì)較少，分析對(duì)象主要為飼料，少數(shù)為動(dòng)物性食品，分析手段有微生物法[6-7]、薄層色譜法[8]、液相色譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5,10-11]；恩拉霉素人工抗原方面的研究亦有一定報(bào)道[12-13]，但未見相關(guān)免疫分析方法的報(bào)道。而動(dòng)物性食品中恩拉霉素的分析方法多為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，分析對(duì)象為雞肉[5,10]和豬肉[11]，待測(cè)物均為恩拉霉素A和恩拉霉素B，目前尚未見有關(guān)動(dòng)物肝臟中恩拉霉素的分析方法報(bào)道；所建方法均采用固相萃取進(jìn)行凈化，凈化小柱有Waters Oasis HLB、Agilent Bond Elut ENV以及IRISTMPolymeric SPE，前處理較復(fù)雜，且Boison等[5]建立的方法對(duì)雞肉中恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66 μg/kg和50 μg/kg，無法滿足相關(guān)殘留限量的要求。本研究利用恩拉霉素易溶于稀鹽酸的特點(diǎn)，建立了稀鹽酸-乙腈混合溶液提取，有機(jī)溶劑液液萃取凈化，LC-MS/MS分析豬肝臟中恩拉霉素的方法。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，能滿足相關(guān)殘留監(jiān)控的需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC超高效液相色譜儀、XevoTMTQ-S micro串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)，配置電噴霧離子源；Ultra-Tyrrax T25型勻質(zhì)器(德國(guó)IKA公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

恩拉霉素A和恩拉霉素B均由安徽普洛生物科技有限公司提供，含量分別為98.6%和92.3%。甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；鹽酸、乙酸乙酯和正己烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫條件：在0.5 min內(nèi)保持80%A，然后在2.5 min內(nèi)線性降至25%A，保持2 min后在0.1 min內(nèi)線性升至80%A，保持1.9 min。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子模式電離；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓為2.0 kV；萃取錐孔電壓為25 V；RF透鏡電壓為0.5 V；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；錐孔氣流速為50 L/h；脫溶劑氣流速為1 000 L/h；其它條件見表1。

表1 恩拉霉素A和恩拉霉素B的保留時(shí)間、母離子、子離子、錐孔電壓及碰撞能量Table 1 Retention times,precursor ions，product ions，cone voltages and collision energies of enramycin A and enramycin B

*quantitative ion

1.3 樣品前處理

稱取試樣2.5 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7，體積比)，以10 000 r/min均質(zhì)1 min，再以9 500 r/min離心5 min后，取上清液，相同條件下重復(fù)提取1次，合并提取液，依次加入8 mL乙酸乙酯和2 mL正己烷，渦旋1 min后以5 000 r/min離心2 min，取下層水相(約6.5 mL)，用0.1%甲酸定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后，供LC-MS/MS測(cè)定。

1.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

利用經(jīng)測(cè)定不含恩拉霉素的豬肝臟樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，樣品處理與“1.3”方法相同，恩拉霉素A和恩拉霉素B的加標(biāo)濃度為15、30、60 μg/kg。樣品稱樣后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放置0.5 h后進(jìn)行樣品處理。

1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按照“1.4”進(jìn)行空白加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每一加標(biāo)濃度進(jìn)行3批次實(shí)驗(yàn)，每批次5個(gè)平行樣品，計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及批間RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

多肽類抗生素因結(jié)構(gòu)上含有氨基基團(tuán)而在正離子模式下易帶正電荷，且易帶2個(gè)或3個(gè)電荷[5]。本實(shí)驗(yàn)用0.1%甲酸溶液-甲醇(80∶20，體積比)分別配制1.0 mg/L的恩拉霉素A和恩拉霉素B單標(biāo)溶液，發(fā)現(xiàn)相同條件下恩拉霉素A和恩拉霉素B帶3個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)分別約為帶2個(gè)和4個(gè)電荷準(zhǔn)分子離子峰響應(yīng)的50倍和10倍，因此優(yōu)化得到帶3個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)譜條件(表1)。其中定量離子對(duì)(m/z786.0>95.0和m/z790.8>95.0)與文獻(xiàn)報(bào)道相同[5,10-11]，本方法選擇的定性離子為m/z1 089.0，與文獻(xiàn)[5]中恩拉霉素B的定性離子一致。

采用超高效液相色譜常用的Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)在“1.2”的梯度條件下，對(duì)比了水相中甲酸濃度為0.1%、0.2%和0.4%，有機(jī)相為甲醇或乙腈時(shí)恩拉霉素A和恩拉霉素B的分離效果，發(fā)現(xiàn)恩拉霉素A和恩拉霉素B在甲酸為0.1%時(shí)的響應(yīng)和信噪比均最好；且有機(jī)相為甲醇時(shí)，恩拉霉素A和恩拉霉素B的響應(yīng)比有機(jī)相為乙腈時(shí)高70%左右，信噪比約高40%，因此確定以0.1%甲酸溶液-甲醇為流動(dòng)相。

圖1 不同體積比0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑對(duì)恩拉霉素提取回收率的影響(加標(biāo)200 μg/kg)Fig.1 Effects of different volume ratio for 0.1 mol/L HCl- acetonitrile on recoveries of enramycin (added 200 μg/kg) volume ratio of 0.1 mol/L HCl to acetonitrile(1-5):5∶5, 4∶6,3∶7,2∶8,1∶9,respectively

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

目前多肽類抗生素常用的提取劑有甲醇[14]、甲醇-水[5,15-16]、鹽酸-乙腈[10-11]等。而恩拉霉素易溶于鹽酸，因此本研究按照“1.3”的方法對(duì)比了不同比例0.1 mol/L鹽酸和乙腈混合溶劑的提取效果(圖1)，發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L鹽酸和乙腈的體積比為3∶7、4∶6和5∶5時(shí)的提取回收率均高于92.0%，且差異較?。煌瑫r(shí)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)乙腈比例越高，基質(zhì)效應(yīng)越小，因此本研究采用0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)作為提取溶劑。

對(duì)于動(dòng)物性食品中多肽類抗生素的凈化目前多采用固相萃取法，萃取小柱主要有HLB、PLS、Strata-X、Bond Elut ENV和IRISTMPolymeric SPE等[5,10-11,14-16]?？紤]到恩拉霉素易溶于鹽酸，本研究嘗試在提取液中加入有機(jī)溶劑采用液液萃取凈化提取液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)按“1.3”步驟得到的加標(biāo)樣品提取液中加入8 mL乙酸乙酯渦旋后，水相和有機(jī)相分層較好，但由于分層后水相體積較少(約2.5 mL)，回收率(n=3)只有(42±2)%左右；而固定加入8 mL乙酸乙酯，同時(shí)加入不同體積(1、2、3 mL)正己烷時(shí)的回收率(n=3)分別為(65±3)%、(83±4)%和(82±4)%。當(dāng)正己烷體積從1 mL增至2 mL時(shí)，上層溶液的極性逐漸變?nèi)醵鴮?dǎo)致更多水從上層析出，下層水相體積從2.5 mL增至6.5 mL左右，最終導(dǎo)致回收率逐漸增加；當(dāng)正己烷體積從2 mL增至3 mL時(shí)，下層水相體積基本不變，回收率變化也較小，因此選擇加入2 mL正己烷。同時(shí)對(duì)直接提取進(jìn)樣、液液萃取、ENV固相萃取凈化(按“1.3”提取，氮吹至無有機(jī)相后按文獻(xiàn)[10]操作)的基質(zhì)效應(yīng)(以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比表示)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)液液萃取凈化的基質(zhì)效應(yīng)得到了明顯改善，與固相萃取凈化的基質(zhì)效應(yīng)差異較小，但操作更加簡(jiǎn)單快速，且空白樣品無雜質(zhì)干擾(圖2A)；同時(shí)最終上樣溶液經(jīng)樣品提取凈化等步驟處理后，含鹽酸濃度約為0.06 mol/L，且僅作為進(jìn)樣溶液未作為流動(dòng)相，大量進(jìn)樣(方法研究和實(shí)際樣品分析)后未發(fā)現(xiàn)對(duì)ESI源的噴霧電流和ESI污染有明顯影響，因此采用加入乙酸乙酯和正己烷液液萃取的方法進(jìn)行樣品凈化。

2.3 線性實(shí)驗(yàn)

在經(jīng)“1.3”處理的空白樣品下層凈化液中加入適量恩拉霉素A和恩拉霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制2.0、10、20、50、100、200、500 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以定量離子對(duì)峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，μg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B在2.0～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為Y=89.6X+205(r2=0.998 9)和Y=97.8X+189(r2=0.997 8)。

2.4 方法的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與檢出限

按照“1.4”和“1.5”方法進(jìn)行加標(biāo)和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，恩拉霉素A和恩拉霉素B的平均回收率為80.8%～90.3%，批內(nèi)RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%。分別以信噪比S/N=3和S/N=10計(jì)算檢出限和定量下限，恩拉霉素A和恩拉霉素B在豬肝臟中的檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg(表2)。本方法的靈敏度與文獻(xiàn)[10]相當(dāng)，明顯優(yōu)于文獻(xiàn)[5]的方法靈敏度(恩拉霉素A和恩拉霉素B的定量下限分別為66、50 μg/kg)；同時(shí)本方法操作更簡(jiǎn)便，單個(gè)樣品從前處理到分析僅需0.5 h左右，比現(xiàn)有方法耗時(shí)短(通常需1.5～3 h)。空白豬肝臟樣品的加標(biāo)回收MRM色譜圖見圖2B。

表2 豬肝臟中恩拉霉素的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限和定量下限Table 2 Average recoveries,relative standard deviations(RSD),the limits of detection(LOD) and the limits of quantitation(LOQ) of enramycin in swine liver

圖2 空白豬肝臟樣品(A)和加標(biāo)樣品(B，15 μg/kg)的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of swine liver blank sample(A) and fortified sample(B,15 μg/kg)

2.5 方法應(yīng)用

采用優(yōu)化后的樣品前處理方法和分析條件分別對(duì)采自寧波當(dāng)?shù)卮笮统械?2個(gè)豬肝臟樣品進(jìn)行了分析，均未檢出恩拉霉素A和恩拉霉素B。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化樣品提取和儀器條件，建立了豬肝臟樣品中恩拉霉素A和恩拉霉素B同時(shí)分析的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。樣品經(jīng)0.1 mol/L鹽酸-乙腈(3∶7)提取后，通過加入有機(jī)溶劑液液萃取凈化即可滿足分析要求。經(jīng)方法驗(yàn)證，恩拉霉素A和恩拉霉素B在15、30、60 μg/kg加標(biāo)濃度下，平均回收率為80.8%～90.3%，批內(nèi)RSD為0.90%～4.5%，批間RSD為3.0%～4.3%，檢出限分別為3.0、4.0 μg/kg，定量下限分別為10、12 μg/kg。該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，能夠滿足實(shí)際殘留監(jiān)控的需要。