呂小會，羅輝泰，黃曉蘭*，吳惠勤，霍延平，張秋炎，朱志鑫

(1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室,廣東 廣州 510070)

精油最早起源于古埃及，是貴族生活中的奢侈品。而隨著社會的進步，生活水平的提高，消費觀念的轉(zhuǎn)變，具有天然生物活性的植物精油成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚淖o膚品[1]。植物精油具有抗氧化、清除自由基、抑制真皮層基質(zhì)降解酶活性的作用，從而可以更新改善真皮層基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，達到保健美容功能[2]。這些功能的實現(xiàn)是由于植物精油中的活性分子小、易滲透，可以迅速地通過表層皮膚滲透進入皮膚底層，促進皮膚的血液循環(huán)，起到調(diào)理皮膚、美膚的作用，因此精油具有“液體黃金”的美譽[3]，精油類化妝品的熱度也逐年增加。

植物精油提取自植物的花、葉、莖、根或果實，主要通過水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界萃取法和亞臨界水提取法[4]定向獲取和濃縮植物中的多種有效成分。天然植物中，除了有利于人體的生物活性因子外，還有一些不利于人體的物質(zhì)，例如分布極其廣泛的植物次生代謝產(chǎn)物生物堿[5]。植物精油的沸點大部分為150～300 ℃，因此在精油提取過程中會導(dǎo)致天然植物中部分生物堿存在殘留。由于部分生物堿具有很強的生物活性和一定的毒性，例如微量的鉤吻堿、烏頭堿會致命，秋水仙堿可誘導(dǎo)染色體變異，雷公藤成為半個世紀以來發(fā)生中毒最多的中藥之一，其毒性成分中生物堿含量位居第2位[6]，因此精油類化妝品的安全性日益成為廣大消費者關(guān)注的問題。在歐盟化妝品規(guī)程[7]及中國2015版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[8]中均明確將部分有毒生物堿列為化妝品組分中的禁用物質(zhì)，2019年7月實施的最新國家標準方法[9]也頒布了化妝品中10 種生物堿的檢測方法，因此精油類化妝品中生物堿的檢測和監(jiān)控應(yīng)受到重視。

目前，國內(nèi)外關(guān)于生物堿檢測研究的文獻較多，主要有高效液相色譜法(HPLC)[10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[13-17]，其中HPLC-MS/MS法較為常見，主要由于大部分生物堿為較難揮發(fā)的物質(zhì)，不適用于GC-MS法檢測。已有文獻對生物堿的研究主要集中于體液、食品、藥材等方面，而關(guān)于化妝品中生物堿檢測方法的文獻報道不多。其中，文獻[18-21]采用HPLC-MS/MS法測定了化妝品中的生物堿，但測定種類較少，且所涉及的化妝品基質(zhì)為水劑和乳液膏霜類等，精油類化妝品中生物堿的檢測方法未見報道。另一方面，隨著化妝品由單一檢測指標朝著多元檢測指標發(fā)展，化妝品中需檢測的物質(zhì)通常包括同一類物質(zhì)中的多種化合物[22]。因此，本文針對化妝品中的植物精油基質(zhì)，研究多種生物堿的高通量檢測方法，建立了HPLC-MS/MS同時測定精油類化妝品中31 種生物堿的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1200SL Series RRLC-6410B Triple Quard MS 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；KQ3200型臺式機械超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；XW-80A快速混勻器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司)，甲酸( LC-MS級，美國Sigma公司)；實驗用水為二次蒸餾水。

標準品：雷公藤次堿、雷公藤吉堿、黃華堿、鉤吻素子、秋水仙堿、山梗菜堿購于上海同田生物科技有限公司，東莨菪堿、麻黃堿、倒千里光堿、麥角新堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿購于天津一方科技有限公司，阿托品、氧化苦參堿、鉤吻素甲、那可丁、吳茱萸堿、蘆竹堿和哈爾堿購于阿拉丁試劑公司，青藤堿和毒扁豆堿購于Sigma公司，山莨菪堿、士的寧、馬錢子堿、延胡索乙素、毛果蕓香堿、西伐丁、苯甲酰次烏頭原堿和高三尖杉酯堿購于中國藥品生物制品檢定所。以上標準品的純度均大于98%。

樣品：客戶送檢的植物精油類化妝品，取樣前混合均勻。

1.2 標準溶液的配制

準確稱量適量31 種生物堿標準品，用甲醇分別溶解，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單標準儲備液，置于棕色瓶中于-20 ℃保存。根據(jù)需要，吸取各單標準儲備液適量，用20%甲醇稀釋并配制成10 mg/L的混合標準工作溶液，置于棕色瓶中于4 ℃保存。吸取適量10 mg/L混合標準工作溶液用甲醇-水(3∶1，體積比)稀釋成2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列混合標準工作溶液。同時吸取適量的10 mg/L混合標準工作溶液用陰性空白基質(zhì)提取液稀釋定容，得到質(zhì)量濃度為2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列基質(zhì)匹配工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取均勻試樣1.0 g(精確至0.01 g)于25 mL具塞比色管中，用含有2%甲酸的甲醇-水(3∶1)定容至10 mL，在快速混勻器上充分渦旋混勻1 min，超聲提取10 min，再加入1 mL正己烷，渦旋5 min，4 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層，過0.22 μm有機濾膜，待HPLC-MS/MS分析。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件HPH-C18色譜柱(2.7 μm，100 mm×2.1 mm)；柱溫：35 ℃；流動相A：0.2%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；流速：0.35 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～3 min，96%～92% A；3～5 min，92%～90% A；5～8 min，90%～88% A；8～10 min，88%～81% A；10～13 min，81%～75% A；13～15 min，75%～55% A；15～16 min，55%～35% A；16～17 min，35%～96% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣壓力：276 kPa；干燥氣流速：8 L/min；干燥氣溫度：300 ℃；毛細管電壓：4 000 V。31種生物堿的保留時間、母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞能量見表1。

表1 31種生物堿的CAS號、保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 CAS numbers，retention times and MS parameters of 31 alkaloids

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于生物堿的分子結(jié)構(gòu)中含有N原子，N原子上的孤電子對易與質(zhì)子結(jié)合，因此本實驗采用正離子模式(ESI+)，在一級質(zhì)譜全掃描模式下采集正離子信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)31種生物堿的特征母離子均為[M+H]+。再以分子離子為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，采集全掃描的二級質(zhì)譜圖，得到碎片離子信息，選取豐度較強且干擾較小的2個子離子分別作為定量離子和定性離子，再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使定量離子和定性離子的響應(yīng)最大，最終得到31種生物堿的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

良好的色譜分離是定性定量分析的前提和關(guān)鍵，根據(jù)前期分離生物堿的經(jīng)驗，分別選擇填料為內(nèi)嵌極性基團鍵合相的反相色譜柱Bonus-RP(3.0 μm,100 mm×2.7 mm)和填料為表面多孔層的反相色譜柱HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)進行分離。結(jié)果顯示，采用Bonus-RP(3.0 μm,100 mm×2.7 mm)時，山梗菜堿、山莨菪堿的峰形差，總離子流圖中出現(xiàn)了較多包峰，分離度較差；采用HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)色譜柱時，黃華堿、毛果蕓香堿和氧化苦參堿的出峰時間較早，可能是由于HPH-C18的填料對吡啶烷類生物堿的鍵合能力較弱，從而導(dǎo)致保留較弱，但整體上可得到很好的峰形，分離度亦有明顯改善，因此選擇HPH-C18(2.7 μm,100 mm×2.1 mm)色譜柱。

流動相的選擇對目標物的分離、靈敏度以及峰形有很大影響，實驗發(fā)現(xiàn)以乙腈為有機相時31種目標化合物的峰形較好。此外，由于生物堿均含有N原子，其N原子上的孤電子對能接受質(zhì)子而對pH值較敏感，在pH較低時生物堿會以結(jié)合狀態(tài)存在，所以在水相中加入適量甲酸有助于[M+H]+的形成，提高響應(yīng)，并改善峰形[23]。實驗結(jié)果表明，以0.2%甲酸水溶液-乙腈為流動相時最為理想。最后進一步優(yōu)化梯度洗脫程序，使目標化合物獲得良好的分離，且保留時間分布相對均勻。 31種生物堿的定量離子對色譜圖見圖1。

圖1 31種生物堿的分子結(jié)構(gòu)和定量離子對的MRM色譜圖Fig.1 Molecular structures and quantitative ion pair MRM chromatograms of 31 alkaloids the order is the same as that in Table 1

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化實驗比較了以甲醇或乙腈為提取溶劑時的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)甲醇比乙腈提取后的響應(yīng)高，因此選擇甲醇為提取溶劑。當提取液中有機相為100%時，極性強的生物堿色譜峰出現(xiàn)前延現(xiàn)象，且峰形差，因此考察了甲醇與水在不同比例下的回收率和色譜峰形，結(jié)果顯示甲醇與水的體積比為3∶1時，31種生物堿的離子峰強度較好，同時峰形也較理想。由于生物堿大多數(shù)為弱堿性化合物，在提取溶劑中加入酸易形成生物堿鹽，可增加生物堿的水溶性，而多數(shù)生物堿鹽可溶于甲醇中。因此比較了在提取溶劑中加入不同含量甲酸對31種生物堿提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)加入甲酸的含量為2%時，各生物堿的回收率較高，最終確定以含2%甲酸的甲醇-水(3∶1，體積比)為提取劑。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化精油中含有較多油脂類物質(zhì)，因此樣品前處理的關(guān)鍵是去除油脂，同時樣品凈化程度高，有利于對色譜柱和儀器的保護。EMR-Lipid固相萃取小柱具有選擇性吸附復(fù)雜基質(zhì)中脂質(zhì)的作用，同時也具有高效的凈化能力；正己烷是一種傳統(tǒng)的除脂溶劑。因此分別考察了正己烷和EMR-Lipid小柱對油脂的去除效果，結(jié)果顯示，與正己烷除脂相比，EMR-Lipid小柱在降低基質(zhì)效應(yīng)方面無明顯優(yōu)勢。這是由于EMR-Lipid小柱主要對含5 個以上碳鏈的脂肪類物質(zhì)的去除效果較好，而精油中一般不含有較長鏈的脂肪類物質(zhì)，因此本實驗采用正己烷除脂，操作更為簡便且節(jié)約成本。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

質(zhì)譜分析尤其是電噴霧質(zhì)譜分析往往存在基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)，從而影響分析方法的靈敏度、精密度和準確度[24]。將“1.2”配制的系列混合標準工作溶液上機測定，以定量離子峰面積為縱坐標(y)，對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，μg/L)，繪制標準工作曲線。本實驗采用基質(zhì)標準曲線擬合的線性方程斜率與溶劑標準曲線線性方程斜率的比值(Slope ratio,SR)[25-26]評價基質(zhì)效應(yīng)。若SR=100%，說明無基質(zhì)效應(yīng)；若SR為80%～120%，說明存在基質(zhì)效應(yīng)，但影響不大；當50%150%，表示基質(zhì)效應(yīng)強烈[27]。由表2可知，13%的生物堿在精油中的基質(zhì)效應(yīng)不大，52%的生物堿屬于中等程度的基質(zhì)效應(yīng)，16%的生物堿接近于中等程度的基質(zhì)效應(yīng)，19%的生物堿屬于強烈的基質(zhì)效應(yīng)，其中有雷公藤次堿、苯甲酰次烏頭原堿、雷公藤吉堿、氧化苦參堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰新烏頭原堿。目前，基質(zhì)效應(yīng)可在前處理或儀器分析時消除[28]。在儀器分析時消除基質(zhì)影響一般采用基質(zhì)匹配標準溶液作校準曲線或通過內(nèi)標法進行校正。因此,本實驗采用基質(zhì)匹配標準溶液作校準曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表2 31種生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects,linear ranges，LODs and LOQs of 31 alkaloids

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

在最優(yōu)的色譜-質(zhì)譜條件下，對質(zhì)量濃度為2.5、10、20、50、100、250、500 μg/L的系列混合標準工作溶液進行測定。以各待測物的定量離子對峰面積為縱坐標(y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，μg/L)繪制標準曲線，結(jié)果顯示31 種生物堿在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992 8～1.000 0(見表2)。通過測定質(zhì)量濃度為2.5 μg/L的基質(zhì)混合標準工作溶液，計算得到各化合物的檢出限(LOD，S/N=3)為0.09～3.03 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)為0.31～10.12 μg/kg，結(jié)果見表2。

2.6 回收率與相對標準偏差

取陰性精油化妝品，進行3個濃度水平(LOQ、2LOQ、10LOQ)的加標回收實驗，每個水平平行測定6次，計算各待測物的平均回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示，3 種加標濃度的平均回收率為63.3%～126%，RSD為0.73%～17%(見表3)，方法的回收率和精密度均能滿足日常檢測的要求。

表3 31種生物堿在精油化妝品基質(zhì)中的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations for 31 alkaloids in essential oil cosmetics

2.7 實際樣品的檢測

按照本方法對20 個精油類化妝品進行檢測，均未檢出待測31 種生物堿。選取其中代表性的10 個樣品，加入20 μg/L的31 種生物堿混合標準溶液，按照本方法進行提取并測定，得到加標回收率為69.1%～112%，符合質(zhì)控要求。

3 結(jié) 論

本研究建立了HPLC-MS/MS同時測定精油類化妝品中31 種生物堿的分析方法，樣品以含有2%甲酸的甲醇-水(3∶1)作為提取劑，正己烷除脂，通過HPH-C18色譜柱實現(xiàn)了31 種組分的分離。該方法樣品前處理簡便、高效、經(jīng)濟，色譜分離效果好，檢出限為0.09～3.03 μg/kg，同時方法的回收率和精密度均能滿足日?；瘖y品中生物堿的檢測要求。