李海紅，劉荔貞，馮 鋒,*

(1.山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；2.山西大同大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009)

異鼠李素(ISOR)是一種從黃酮類化合物中分離得到的天然單體，主要來源于沙棘果實和銀杏葉。ISOR有重要的藥用價值，如保護(hù)心血管，抗腫瘤抗癌，調(diào)節(jié)免疫功能，尤其在心血管保護(hù)，抑制血管平滑肌細(xì)胞增生肥大，抗血栓形成方面[1-2]效果顯著。ISOR在疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用，因此尋找一種簡單、快速、高選擇性檢測ISOR的方法顯得尤為重要。目前檢測ISOR的方法主要包括薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法[3-6]。但是，這些方法對設(shè)備要求高、操作步驟復(fù)雜、耗時長、檢測成本高。相比于其它分析方法，熒光探針分析法具有操作簡單、靈敏度高、高效快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

熒光碳量子點(diǎn)(CDs)是一種新型的碳納米材料，因具有良好的光電性質(zhì)和廣闊的應(yīng)用前景得到了廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)半導(dǎo)體金屬量子點(diǎn)相比，CDs具有親水性、低毒性、光致發(fā)光性、生物相容性、化學(xué)及光穩(wěn)定性和易于功能化等優(yōu)點(diǎn)。目前合成CDs的方法主要有電弧放電法、激光燒蝕法、電化學(xué)氧化法、水熱法、超聲振蕩法和微波法等[7-12]。在這些方法中，微波合成法以其加熱均勻、操作簡單、量子產(chǎn)率高、耗時短等優(yōu)勢而受到追捧。近年來，CDs在傳感、光催化、金屬離子檢測和細(xì)胞成像等領(lǐng)域得到了發(fā)展[13-17]，但關(guān)于CDs檢測ISOR的方法尚未見報道，因此利用CDs檢測ISOR具有重要的研究意義。

本文以L-天冬氨酸和尿素為原料，采用微波加熱法制備了一種新型的、具有良好熒光穩(wěn)定性與水溶性的熒光碳量子點(diǎn)。ISOR對該CDs具有明顯的熒光猝滅作用，在一定范圍內(nèi)，CDs的熒光猝滅程度與ISOR濃度呈良好的線性關(guān)系。將制備的CDs用于藥物銀杏葉片中ISOR的檢測，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

JEOL-2100F透射電鏡(日本JEOL公司)；FT-IR-680傅立葉變換紅外光譜儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司)；Escalab 250Xi X射線光電子能譜(XPS)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Lambda 35紫外-可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司);F-2500熒光分光光度計(日本日立公司);FLS 920熒光光譜儀(愛丁堡儀器有限公司)。

分子截留量500 Da透析膜(北京生物試劑耗材實驗室公司)；L-天冬氨酸(天津威臣化學(xué)試劑公司)；二甲基亞砜(DMSO)、尿素(天津克美化學(xué)試劑公司)；異鼠李素(上海瑞初生物技術(shù)公司);阿魏酸(Fer)、蘆丁(Rut)、大黃酚(Chr)、大豆黃酮(Dai)(阿拉丁試劑公司)。所有試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CDs的合成稱取1 gL-天冬氨酸和1 g 尿素溶解于10 mL蒸餾水中，微波加熱4 min，得到深褐色粘稠液體，自然冷卻至室溫，用20 mL蒸餾水稀釋，稀釋后溶液呈透明亮黃色。將該溶液經(jīng)分子截留量為500 Da的透析袋透析24 h，除去溶液中未反應(yīng)的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到CDs固體產(chǎn)品。

1.2.2 測定方法將0.6 mL CDs溶液(3 mol/L)與1.4 mL的磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L，pH 6.0)混合后，將不同濃度的ISOR加入該溶液中，在固定激發(fā)波長(350 nm)下，測定熒光發(fā)射光譜(200～700 nm)，發(fā)射和激發(fā)狹縫均設(shè)為5 nm。固定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350 nm和370 nm，記錄熒光強(qiáng)度IF和IF0(IF和IF0分別為ISOR存在與不存在時的CDs熒光強(qiáng)度)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CDs的表征

利用透射電鏡進(jìn)行CDs形貌表征。如圖1A所示，制備的CDs為近似球形結(jié)構(gòu)且保持較好的分散性，顆粒大小在2～8 nm之間(圖1B)，平均粒徑為5 nm。

圖1 CDs 的TEM電鏡圖(A)與粒徑分布圖(B)Fig.1 TEM image(A) and particle size distribution(B) of CDs

圖2 CDs 的XPS光譜(A)、紅外光譜(B)、不同激發(fā)波長下的熒光光譜(C)以及紫外-可見吸收(Abs)、激發(fā)(Ex)、發(fā)射(Em)光譜(D)Fig.2 XPS spectrum(A),FTIR(B),fluorescence spectra(C)and UV-Vis absorption spectrum(Abs),excitation(Ex) and emission(Em) spectrum of CDs(D) A1-A3:XPS spectra of C1s,N1s,O1s,respectively;insert in D：photographs of the solution of the CDs taken under visible light(left) and 365 nm UV light(right)

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 熒光碳點(diǎn)濃度實驗考察了CDs濃度對熒光強(qiáng)度的影響。由圖3A可知，在0.2～0.6 mmol/L濃度范圍內(nèi),CDs熒光強(qiáng)度隨著CDs濃度增加而增加，濃度為0.6 mmol/L時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值，此后熒光強(qiáng)度隨濃度增加而減弱。因此實驗選擇CDs最佳濃度為0.6 mmol/L。

2.2.2 溶液酸度實驗在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系中考察了pH值對CDs熒光猝滅的影響。如圖3B所示，pH 2.0～5.0時，CDs的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增加而逐漸增大。pH>5.0時，CDs的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增加而降低，因此實驗選擇在pH 5.0的緩沖溶液中進(jìn)行。

2.2.3 反應(yīng)時間及穩(wěn)定性室溫下，記錄了反應(yīng)時間對CDs熒光猝滅的影響。由圖3C所示，加入20 μL ISOR(3 mmol/L)后，2 min內(nèi)CDs的熒光猝滅程度明顯，此后，其猝滅程度趨于平緩，且在1 h內(nèi)基本保持不變。所以實驗選擇反應(yīng)時間為2 min。為了探究CDs的穩(wěn)定性，將CDs在4 ℃條件下保存3個月，熒光強(qiáng)度無明顯變化，說明所制備的CDs具有良好的穩(wěn)定性。

2.3 共存物質(zhì)的影響

為了驗證CDs的選擇性，考察了常見金屬離子(Zn2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、K+、Na+)和藥物中可能存在的成分(阿魏酸、蘆丁、大黃酚、大豆黃酮)對CDs熒光強(qiáng)度的影響。金屬離子以及化合物濃度均為0.01 mol/L，結(jié)果如圖3D所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，上述物質(zhì)對CDs的熒光干擾很微弱，基本可以忽略。因此所制備的CDs具有較高的選擇性，可用于實際樣品的檢測。

圖3 CDs濃度(A)、pH值(B)、反應(yīng)時間(C)及常見干擾離子和藥物中可能存在的物質(zhì)(D)對CDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of CDs concentrations(A),pH value(B),reaction time(C) and the presence of various metal ions and substances(D) on the fluorescence response of CDs

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在上述優(yōu)化實驗條件下,ISOR濃度(c，nmol/L)在0.22～180 nmol/L范圍內(nèi)與CDs的熒光猝滅程度(IF0/IF)間存在良好的線性關(guān)系，回歸方程為IF0/IF=1+0.2111c，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 7，以LOD=3S/K(S為10個空白測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計算出檢出限為1.32 nmol/L。

2.5 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅主要分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅[24]。如圖4A所示，ISOR的紫外吸收光譜與CDs的發(fā)射和激發(fā)光譜重疊，表明CDs與ISOR之間存在能量傳遞，由于在激發(fā)態(tài)下發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移過程，CDs的熒光被ISOR猝滅。熒光壽命檢測是研究猝滅機(jī)理的重要手段。對于靜態(tài)猝滅，熒光壽命不發(fā)生改變(τ0/τ=1)(τ0和τ分別表示含有和未含ISOR時CDs的熒光壽命)。相反，對于動態(tài)猝滅，τ0/τ=IF0/IF，隨著ISOR濃度的增加，熒光壽命減弱。如圖4B所示，CDs的熒光壽命和(CDs+ISOR)的熒光壽命基本相同(τ0/τ≈ 1)。說明靜態(tài)猝滅是加入ISOR后CDs熒光猝滅的主要機(jī)制。

圖4 ISOR的紫外-可見吸收光譜和CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜(A)與 CDs及CDs+ISOR熒光壽命曲線圖(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(Abs) of ISOR，fluorescence excitation(Ex) and emission(Em) spectra of CDs(A) and fluorescence emission decay curves of CDs and CDs+ISOR system(B)

2.6 實際樣品測定

選取藥店購買的銀杏葉片作為實際檢測樣品。藥片去除糖衣研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.5 g藥品粉末，用V水∶VDMSO=1∶1溶液將其溶解并定至50 mL，超聲30 min，取上清液進(jìn)行測定。取2 mL CDs與樣品上清液10 μL充分混合后測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出藥品中含有異鼠李素0.02 μmol/L。分別加入4、8、12、24、30 μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品(異鼠李素3 μmol/μL)混合均勻后，依次測量該5組混合液的熒光強(qiáng)度，將得到的熒光猝滅程度結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實測值。每組實驗測定3次，計算回收率，結(jié)果見表1。其加標(biāo)回收率為90.8%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于 3%。結(jié)果表明，本方法可用于藥品中ISOR的檢測。

表1 銀杏葉片中ISOR的測定Table 1 Determination of ISOR in ginkgo leaf tablets

3 結(jié) 論

本文以L-天冬氨酸和尿素為原料，采用微波加熱法制備了一種新型CDs。實驗結(jié)果表明，制備的CDs水溶性好、穩(wěn)定性高，對ISOR具有單一選擇性。CDs熒光猝滅程度(IF0/IF)與ISOR濃度在0.22～180 nmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢出限為1.32 nmol/L。該方法具有操作簡單、成本低、耗時短、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，為ISOR檢測提供了一種選擇性高、靈敏性好以及抗干擾性強(qiáng)的方法。