陳秀明，周璟明，林 斌，鄭孝賢，王海龍，陳楠楠，詹 清，方東升

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350007)

東革阿里(EurycomalongifoliaJack)為苦木科(Simaroubaceae)東革阿里屬植物，廣泛分布于馬來西亞、印度尼西亞、越南等東南亞國家，在原產(chǎn)地被稱為馬來西亞人參、天然偉哥等，與燕窩、錫器并稱為馬來西亞三大國寶，是東南亞最珍貴的應(yīng)用植物藥之一。東革阿里全株均可入藥，常以根入藥，具有抗癌、抗瘧疾、抗菌、抗寄生蟲以及改善男性性功能障礙等功效，還能提升人體機(jī)能、減輕疲勞、調(diào)節(jié)免疫、殺菌、抗?jié)?、降血壓、抗血管生成、治療糖尿病、抗焦慮、鎮(zhèn)痛抗炎及抗骨質(zhì)疏松等多種功效[1-2]。

研究表明，東革阿里中含有多種化學(xué)成分，以苦木素二萜與β-咔巴啉類生物堿兩類化合物為主，此外還含有鐵屎米-6-酮類生物堿、木脂素、角鯊烯衍生物、香豆素、氨基酸類、甾醇類等成分。由于含有獨(dú)特結(jié)構(gòu)類型的化合物和多種重要的生物活性，近年來東革阿里一直備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[3-15]。目前，東革阿里的研究主要集中在化學(xué)成分的提取分離[2,13-15]、少數(shù)成分的定量分析[16-23]和藥理毒理方面[1,3-12,24]，關(guān)于東革阿里及其制劑中化學(xué)成分的綜合定性鑒別卻鮮有報(bào)道，國內(nèi)也未見相關(guān)文獻(xiàn)，因此有必要建立一種快速、高效、全面闡明東革阿里化學(xué)成分的分析方法。

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)對(duì)東革阿里提取物進(jìn)行分析研究，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，鑒定出49種化學(xué)成分，包括29種苦木素二萜、4種β-咔巴啉類生物堿、12種鐵屎米-6-酮類生物堿、3種聯(lián)苯新木脂素及1種角鯊烯型三萜。該方法快速、可靠、高效，能較全面地反映東革阿里的化學(xué)成分，可為深入闡明東革阿里的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供可靠的方法，也可為東革阿里的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜系統(tǒng)；Agilent 6545 Q-TOF質(zhì)譜儀(電噴霧離子源，正離子模式)；微型植物試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；KQ-5200DE數(shù)控型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XSE105十萬分之一分析天平(Mettler Toledo公司)；Milli-Q超純水儀(Millipore公司，USA)；高速離心機(jī)(美國Beckman公司)。

寬纓酮(Eurycomanone)、13α-(21)-環(huán)氧寬纓酮(13α-(21)-Epoxyeurycomanone)、東革內(nèi)酯(Eurycoma lactone)和14,15β-Dihydroxyklaineanone對(duì)照品均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；β-咔巴啉-1-丙酸(β-Carboline-1-propionic acid)對(duì)照品購自上海澤葉生物科技有限公司；9-甲氧基-鐵屎米-6-酮(9-Methoxycanthin-6-one)對(duì)照品購自武漢天植生物科技有限公司。東革阿里藥材購自北京博遠(yuǎn)欣綠生物科技有限公司(規(guī)格：80 g，批號(hào)：20181001)。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merck公司)，乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水由Milli-Q制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的制備供試品溶液的制備：將東革阿里根粉碎過篩，稱取約5.0 g于250 mL三角瓶中，加入30%乙醇水溶液100 mL于90 ℃水浴中加熱提取3次，提取時(shí)間分別為2.0、1.5、1.0 h，4 000 r/min離心分離15 min，合并上清液，減壓濃縮后，取濃縮液(質(zhì)量濃度按寬纓酮計(jì)為167.85 μg/mL)1.0 mL以0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行分析。

對(duì)照品溶液的制備：取寬纓酮、13α-(21)-環(huán)氧寬纓酮、東革內(nèi)酯、14,15β-Dihydroxyklaineanone、β-咔巴啉-1-丙酸和9-甲氧基-鐵屎米-6-酮對(duì)照品，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，加入適量甲醇超聲助溶，放冷后定容至刻度，即得質(zhì)量濃度分別為203.47、183.34、182.26、247.25、195.03、164.64 μg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述貯備液0.5 mL于10 mL棕色量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度分別為10.17、9.167、9.113、12.36、9.752、8.232 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取混合對(duì)照品溶液1.0 mL以0.22 μm微孔濾膜過濾后測(cè)定。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS分析條件色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse Plus-C18RRHD柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0～3 min，5%B，3～20 min，5%～30%B，20～32 min，30%～98%B，32～35 min，98%B，35～40 min，98%～5%B，40～45 min，5%B；流速：0.2 mL/min，柱溫：40 ℃,DAD(G7117A)檢測(cè)，進(jìn)樣量1 μ L。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，采用正離子檢測(cè)模式；鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣流速：11.0 L/min；噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：3 500 V；霧化氣壓力：0.24 MPa(35 psig)；干燥氣溫度：320 ℃，干燥氣流速：8.0 L/min；毛細(xì)管出口電壓：135 V；Skimmer電壓：65 V；八級(jí)桿電壓：750 V；碰撞能量(CE)：15～40 V；全掃描模式采集，掃描范圍：m/z100～800。

2 結(jié)果與討論

2.1 總離子流圖的測(cè)定

采用參比溶液校準(zhǔn)儀器質(zhì)量數(shù)后，取東革阿里提取液，按“1.2.1”制備供試品溶液，“1.2.2”分析條件進(jìn)行測(cè)定，得到正離子模式下的總離子流圖(見圖1)。樣品經(jīng)全掃描后，獲得東革阿里提取液中各色譜峰的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰及MS/MS碎片離子的精確相對(duì)分子質(zhì)量信息。通過與部分對(duì)照品質(zhì)譜信息、參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)，獲得各色譜峰的分子式并進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬，從東革阿里提取液中鑒別出49種化合物，包括29種苦木素二萜、4種β-咔巴啉類生物堿、12種鐵屎米-6-酮類生物堿、3種聯(lián)苯新木脂素及1種角鯊烯型三萜，結(jié)果如表1所示(為方便表述，表中碎片離子(MS/MS fragment ion)均以整數(shù)表示)。

圖1 東革阿里提取液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Eurycoma longifolia Jack extract the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

表1 東革阿里化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of chemical constituents in Eurycoma longifolia Jack by UPLC-Q-TOF-MS

(續(xù)表1)

*identified by comparing with reference standards

2.2 東革阿里化學(xué)成分的鑒定與分析

2.2.1 苦木素二萜類化合物的鑒定由表1可知，在正離子模式下從東革阿里提取物中共鑒定出29種苦木素二萜，根據(jù)結(jié)構(gòu)類別具體包括5種C18laurycomalactone型二萜類(16、37、42～43、45號(hào)峰)、7種C19eurycomalactone型二萜類(9、25、29、31～32、36、44號(hào)峰)、3種C19longilactone型二萜類(12、18、38號(hào)峰)、11種C20eurycomanone型二萜類(3、5～8、10、13～15、19、26號(hào)峰)及3種C20klaineanone型二萜類(21、23、27號(hào)峰)。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜碎片信息、部分對(duì)照品信息及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[17,25]，可知苦木素二萜類化合物的主要裂解途徑為準(zhǔn)分子離子[M+H]+脫去H2O、CO中性碎片和呋喃環(huán)開裂脫去—CH2O，其中準(zhǔn)分子離子單脫水的[M+H-H2O]+碎片多為基峰，以7號(hào)峰為例闡述其裂解過程。

7號(hào)峰的保留時(shí)間為15.057 min，在正離子模式下，一級(jí)質(zhì)譜(圖2A)的準(zhǔn)分子離子([M+H]+)為m/z409.149 3，[M+Na]+和[2M+Na]+離子的m/z分別為431.131 1和839.273 8，推測(cè)其分子式為C20H24O9，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二級(jí)質(zhì)譜(圖2B)中可見準(zhǔn)分子離子脫水后形成的基峰[M+H-H2O]+m/z391.138 8，該碎片離子進(jìn)一步脫水形成[M+H-2H2O]+m/z373.129 7碎片離子，其可通過脫水、脫羰基分別形成[M+H-3H2O]+m/z355.115 4和[M+H-2H2O-CO]+m/z345.133 4的碎片離子，前者通過進(jìn)一步脫羰基或后者通過脫水形成[M+H-3H2O-CO]+m/z327.123 1碎片離子，該碎片離子再通過呋喃環(huán)開裂脫去-CH2O和脫水分別生成[M+H-3H2O-CO-CH2O]+m/z297.111 1碎片離子和[M+H-4H2O-CO]+m/z309.111 8，二者可分別通過脫水和脫去-CH2O生成[M+H-4H2O-CO-CH2O]+m/z279.100 4碎片離子，該碎片離子也可由碎片離子[M+H-3H2O]+m/z355.115 4先后脫水脫羰基及呋喃環(huán)開裂脫去-CH2O后產(chǎn)生，其可進(jìn)一步脫去羰基產(chǎn)生[M+H-4H2O-2CO-CH2O]+m/z251.106 9碎片離子(亦可由[M+H-3H2O-CO-CH2O]+m/z297.111 1碎片離子先后脫羰基脫水產(chǎn)生)，該碎片離子分別通過脫去-CH2CO和-C2H2生成[M+H-4H2O-2CO-CH2OCH2CO]+m/z209.131 6和[M+H-4H2O-2CO-CH2OC2H2]+m/z225.125 0碎片離子，后者進(jìn)一步脫CO最終生成[M+H-4H2O-3CO-CH2OC2H2]+m/z197.130 0碎片離子。以上裂解過程與文獻(xiàn)報(bào)道的寬纓酮的質(zhì)譜裂解途徑一致[17,25]。綜合以上信息，推斷7號(hào)峰的化學(xué)成分為C20eurycomanone型二萜類化合物寬纓酮(Eurycomanone)，精確分子量為408.142 0，分子式為C20H24O9，其為本次檢出的苦木素二萜類化合物中含量最高的組分，常作為東革阿里提取物的指標(biāo)性成分，因分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，存在多種可能脫水方式，圖3給出了其中一種可能的裂解途徑。

圖2 7號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)409.149 3峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.2 MS spectrum of No.7(A) and secondary MS spectrum of 409.149 3(B) in positive ion mode

圖3 寬纓酮的可能裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation process of eurycomanone

10號(hào)峰的保留時(shí)間為15.356 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z411.165 0，[M+Na]+離子的m/z為433.146 3，推測(cè)其分子式為C20H26O9。其結(jié)構(gòu)與寬纓酮相似，結(jié)合苦木素二萜類化合物的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[17]，推測(cè)其為C20eurycomanone型二萜類化合物Eurycomanol(寬纓酮醇)。

2.2.2 生物堿類化合物的鑒定東革阿里植物中分離得到的生物堿大致可分為3類，即β-咔巴啉類生物堿、鐵屎米-6-酮類生物堿和鐵屎米-5,6-二酮類生物堿。通過比較出峰時(shí)間及分析質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)和部分對(duì)照品數(shù)據(jù)信息，在正離子模式下，共鑒定出16種生物堿類化合物，包括4種β-咔巴啉類生物堿、12種鐵屎米-6-酮類生物堿。

2.2.2.1β-咔巴啉類生物堿的鑒定β-咔巴啉類生物堿是東革阿里的主要有效成分之一，本次檢出4種(1～2、4、11號(hào)峰)，分別為1-甲氧基甲基-β-咔巴啉(1-Methoxymethyl-β-carboline)、7-羥基-β-咔巴啉-1-丙酸(7-Hydroxy-β-carboline-1-propionic acid)、β-咔巴啉-1-丙酸(β-Carboline-1-propionic acid)和7-甲氧基-β-咔巴啉-1-丙酸(7-Methoxy-β-carboline-1-propionic acid)，其中β-咔巴啉-1-丙酸含量最高，7-甲氧基-β-咔巴啉-1-丙酸次之。本類化合物由于分子結(jié)構(gòu)中吡啶環(huán)側(cè)鏈含羧基且吲哚環(huán)上多有羥基取代,故極性較大，保留時(shí)間較短，在正離子模式下的裂解方式主要為吡啶并吲哚環(huán)側(cè)鏈羧基脫去H2O、CO中性碎片或-CH2O2、-C2H4O2和-C3H6O2碎片，以及吡啶環(huán)的α裂解，以4號(hào)峰為例闡述其裂解過程。

4號(hào)峰的保留時(shí)間為13.914 min，在正離子模式下一級(jí)質(zhì)譜(圖4A)的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z241.097 0，推測(cè)其分子式為C14H12N2O2，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二級(jí)質(zhì)譜(如圖4B)中首先可見準(zhǔn)分子離子脫水后形成豐度較低的[M+H-H2O]+m/z223.086 3碎片離子，該碎片離子不穩(wěn)定可通過脫CO形成豐度較大的[M+H-CH2O2]+m/z195.091 8碎片離子，其可逐級(jí)脫去吡啶側(cè)鏈烯烴的亞甲基生成[M+H-C2H4O2]+m/z181.076 1和[M+H-C3H6O2]+m/z167.064 6碎片離子，二者可進(jìn)一步發(fā)生吡啶環(huán)的α裂解脫去1分子HCN,分別生成[M+H-C3H5NO2]+m/z154.065 4和[M+H-C4H7NO2]+m/z140.048 5碎片離子。以上裂解過程與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的β-咔巴啉-1-丙酸(β-Carboline-1-propionic acid)的質(zhì)譜裂解途徑一致。綜合以上信息，推斷4號(hào)峰的化學(xué)成分為β-咔巴啉-1-丙酸，精確分子量為240.089 9，分子式為C14H12N2O2，其裂解途徑如圖5所示。

圖4 4號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)241.097 0峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.4 MS spectrum of No.4(A) and secondary MS spectrum of 241.097 0(B) in positive ion mode

圖5 β-咔巴啉-1-丙酸可能的裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation process of β-carboline-1-propionic acid

1號(hào)峰的保留時(shí)間為10.750 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z213.102 1，推測(cè)其分子式為C13H12N2O。通過與β-咔巴啉-1-丙酸類生物堿的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比[17]，推測(cè)其為1-甲氧基甲基-β-咔巴啉。2號(hào)峰的保留時(shí)間為11.794 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z257.091 9，相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子和β-咔巴啉-1-丙酸均相差16 Da，推測(cè)其分子式為C14H12N2O3。通過與β-咔巴啉-1-丙酸類生物堿的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比[17]，推測(cè)其為7-羥基-β-咔巴啉-1-丙酸。

2.2.2.2 鐵屎米-6-酮類生物堿的鑒定東革阿里植物中分離得到的鐵屎米-6-酮類生物堿按結(jié)構(gòu)類別可細(xì)分成3種類型，分別為鐵屎米-6-酮類生物堿(Canthin-6-one)、鐵屎米-6-酮的3-位氮上形成N-氧化物的季銨類生物堿(Canthin-6-one-3-N-oxide)及鐵屎米-5,6-二酮類生物堿(Canthin-5,6-dione)。通過比較出峰時(shí)間及分析質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)和部分對(duì)照品數(shù)據(jù)信息，共鑒定出12種鐵屎米-6-酮類生物堿，包括9種鐵屎米-6-酮類生物堿(17、28、30、34～35、40、46～48號(hào)峰)、2種季銨類生物堿(39、41號(hào)峰)、1種報(bào)道較少的鐵屎米-5,6-二酮類生物堿(22號(hào)峰)，其中鐵屎米-6-酮(46號(hào)峰)、9-甲氧基-鐵屎米-6-酮(47號(hào)峰)的含量最高。該類化合物的主要裂解途徑為母環(huán)中2-吡啶酮脫去CO或-CHO，其次是2-吡啶酮的逆狄爾斯-阿德爾(retro-Diels-Alder，RDA)裂解和吡啶環(huán)的α裂解，此外也可見準(zhǔn)分子離子脫去苯環(huán)上取代基生成的碎片。以46號(hào)峰為例闡述此類化合物的裂解過程。

46號(hào)峰的保留時(shí)間為28.521 min，一級(jí)質(zhì)譜(圖6A)的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z221.070 8，推測(cè)其分子式為C14H8N2O，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二級(jí)質(zhì)譜(圖6B)中首先觀察到準(zhǔn)分子離子分別脫去CO和-CHO后生成的基峰[M+H-CO]+m/z193.075 2和碎片離子[M+H-CHO]+m/z192.068 3，二者可通過RDA裂解脫去-C2H2分別生成碎片離子[M+H-C3H2O]+m/z167.061 0和[M+H-C3H3O]+m/z166.064 1，其中[M+H-C3H2O]+m/z167.061 0也可由準(zhǔn)分子離子發(fā)生2-吡啶酮的RDA裂解脫去-C2H2生成的碎片離子[M+H-C2H2]+m/z195.083 7進(jìn)一步脫CO后產(chǎn)生，該碎片離子可進(jìn)一步發(fā)生吡啶環(huán)的α裂解脫去1分子HCN后，生成碎片離子[M+H-C4H3NO]+m/z140.048 8。以上裂解過程與文獻(xiàn)報(bào)道的鐵屎米-6-酮(Canthin-6-one)質(zhì)譜裂解途徑一致[17]。綜合以上信息并結(jié)合文獻(xiàn)分析，推斷該成分為鐵屎米-6-酮，其裂解途徑如圖7所示。

圖6 46號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)221.070 8峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.6 MS spectrum of No.46(A) and secondary MS spectrum of 221.070 8(B) in positive ion mode

22號(hào)峰的保留時(shí)間為19.909 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z281.091 7，推測(cè)其分子式為C16H12N2O3。結(jié)合鐵屎米-5,6-二酮類生物堿裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果[17]，推測(cè)其為9-甲氧基-3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮(9-Methoxy-3-methylcanthin-5,6-dione)。39號(hào)峰的保留時(shí)間為26.807 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z267.076 1，推測(cè)其分子式為C15H12N2O3。結(jié)合鐵屎米-6-酮-3-N-氧化物(Canthin-6-one-3N-oxide)類生物堿裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果[17]，推測(cè)其為9-甲氧基-鐵屎米-6-酮-3-N-氧化物(9-Methoxycanthin-6-one-3N-oxide)。

此外，在鐵屎米-6-酮類生物堿的鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，部分異構(gòu)體(30號(hào)峰和34號(hào)峰)的保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子均極其相似，因此取代基的連接位置不能確定，僅對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，需要進(jìn)一步獲取對(duì)照品以進(jìn)行最終歸屬。

2.2.3 木脂素類化合物的鑒定東革阿里植物中分離得到的木脂素類化合物，已報(bào)道的有6種，其中有4種聯(lián)苯新木脂素類化合物，本次檢出3種(20、24和33號(hào)峰)。該類化合物的主要裂解途徑為準(zhǔn)分子離子脫去苯環(huán)上的甲基或甲氧基、苯丙素單元上的羥基或整個(gè)基團(tuán)，其次是苯丙素單元分別發(fā)生RDA裂解。以20號(hào)峰為例闡述其裂解過程。

圖7 鐵屎米-6-酮的可能裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation process of canthin-6-one

20號(hào)峰的保留時(shí)間為18.981 min，一級(jí)質(zhì)譜(圖8A)的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z377.159 1，推測(cè)其分子式為C20H24O7，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二級(jí)質(zhì)譜(圖8B)中首先可見準(zhǔn)分子離子分別脫甲基和2分子甲氧基后形成的碎片離子[M+H-CH3]+m/z362.170 5、[M+H-C2H6O2]+m/z315.172 9；其次是準(zhǔn)分子離子優(yōu)先脫去丙三醇基團(tuán)后形成的碎片離子[M+H-C3H6O3]+m/z287.158 5 ，其進(jìn)一步脫水生成基峰[M+H-C3H8O4]+m/z269.153 1，同時(shí)準(zhǔn)分子離子另一側(cè)苯丙素單元的烯丙醇可通過脫水生成[M+H-H2O]+m/z359.110 9碎片離子，其可進(jìn)一步脫去苯環(huán)上2個(gè)甲基生成碎片離子[M+H-C2H6]+m/z329.622 8；再次，在質(zhì)譜圖中可觀測(cè)到準(zhǔn)分子離子中兩個(gè)苯丙素單元發(fā)生RDA裂解分別生成[M+H-C5H8O3]+m/z261.433 1和[M+H-C5H6O]+m/z295.126 2碎片離子，后者可分別通過脫水、脫-CH3OH最終分別生成碎片離子[M+H-C5H8O2]+m/z276.899 3、[M+H-C6H10O2]+m/z263.096 9。以上裂解過程與文獻(xiàn)報(bào)道的2,2′-二甲氧基-4-(3-羥基-1-丙烯基)-4′-(1,2,3-三羥丙基)-二苯醚(2,2′-Dimethoxy-4-(3-hydroxy-1-propenyl)-4′-(1,2,3-trihydroxypropyl)-diphenyl ether)裂解產(chǎn)生的碎片吻合[17]。綜合以上信息并結(jié)合文獻(xiàn)分析，推斷該成分為2,2′-二甲氧基-4-(3-羥基-1-丙烯基)-4′-(1,2,3-三羥丙基)-二苯醚，其裂解途徑如圖9所示。

圖8 20號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)377.159 1峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.8 MS spectrum of No.20(A) and secondary MS spectrum of 377.159 1(B) in positive mode

圖9 2,2′-二甲氧基-4-(3-羥基-1-丙烯基)-4′-(1,2,3-三羥丙基)-二苯醚的可能裂解途徑Fig.9 Proposed fragmentation process of 2,2′-dimethoxy-4-(3-hydroxy-1-propenyl)-4′-(1,2,3-trihydroxypropyl)-diphenyl ether

24號(hào)峰的保留時(shí)間為20.929 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z359.148 5，推測(cè)其分子式為C20H22O6。通過與木脂素衍生物的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，推測(cè)其為2-羥基-3,2′-二甲氧基-4′-(2,3-環(huán)氧-1-羥丙基)-5-(3-羥基-1-丙烯基)聯(lián)苯(2-Hydroxy-3,2′-dimethoxy-4′-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl)-biphenyl)。33號(hào)峰的保留時(shí)間為25.237 min，在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z389.158 9，推測(cè)其分子式為C21H24O7。通過與木脂素衍生物的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，推測(cè)其為2-羥基-3,2′,6′-三甲氧基-4′-(2,3-環(huán)氧-1-羥丙基)-5-(3-羥基-1-丙烯基)聯(lián)苯(2-Hydroxy-3,2′,6′-trimethoxy-4′-(2,3-epoxy-1-hydroxypropyl)-5-(3-hydroxy-1-propenyl)-biphenyl)。

2.2.4 角鯊烯衍生物類化合物的鑒定東革阿里植物中分離得到的角鯊烯衍生物，已報(bào)道的有4種,分別為Eurylene、Longilene peroxide、Teurilene與11/14-Deacetyl eurylene。據(jù)報(bào)道此類化合物均具有很強(qiáng)的抗癌活性。本實(shí)驗(yàn)僅檢出1種(49號(hào)峰)。

49號(hào)峰的保留時(shí)間為36.565 min，一級(jí)質(zhì)譜(圖10A)的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+m/z553.409 1，推測(cè)其分子式為C32H56O7，誤差在±5×10-6范圍內(nèi)。二級(jí)質(zhì)譜(圖10B)中首先可見準(zhǔn)分子離子逐級(jí)脫水后形成的碎片離子[M+H-H2O]+m/z535.397 8、[M+H-2H2O]+m/z517.382 2、[M+H-3H2O]+m/z499.371 4，其中碎片離子[M+H-H2O]+m/z535.397 8可通過脫去—C2H4O2酯基生成碎片離子[M+H-C2H6O3]+m/z475.377 3，該碎片離子可脫水生成基峰[M+H-C2H8O4]+m/z457.365 5(也可由碎片離子[M+H-3H2O]+m/z499.371 4脫去乙酰基產(chǎn)生)，其可進(jìn)一步通過逐級(jí)脫水和α裂解分別生成碎片離子[M+H-C2H10O5]+m/z439.354 7、[M+H-C2H12O6]+m/z421.340 1和[M+H-C19H34O6]+m/z195.170 5；其次，準(zhǔn)分子離子可脫去甲基和側(cè)鏈乙?；笮纬伤槠x子[M+H-C3H6O]+m/z495.443 7；此外，還可觀察到準(zhǔn)分子離子直接α裂解生成的碎片離子[M+H-C19H32O5]+m/z213.161 9。綜合以上信息并結(jié)合文獻(xiàn)[17]，推斷該成分為11-Deacetyl eurylene或14-Deacetyl eurylene，圖11以11-Deacetyl eurylene為例列出了其可能的裂解途徑。

圖10 49號(hào)峰在正離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)與精確質(zhì)量數(shù)553.409 1峰的二級(jí)質(zhì)譜圖(B)Fig.10 MS spectrum of No.49(A) and secondary MS spectrum of 553.409 1(B) in positive ion

圖11 11-Deacetyl eurylene的可能裂解途徑Fig.11 Proposed fragmentation process of 11-deacetyl eurylene

2.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

為驗(yàn)證“2.2”中所鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)的可靠性，在相同條件下分別測(cè)定其色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，若目標(biāo)成分與其對(duì)照品的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、同位素分布和二級(jí)特征離子吻合，則可判定為該化合物。如上文中鑒定精確質(zhì)量數(shù)為409.149 3的7號(hào)峰為寬纓酮，則以其標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，在相同條件下測(cè)定寬纓酮對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，寬纓酮對(duì)照品及東革阿里樣品中精確質(zhì)量數(shù)為409.149 3的組分的保留時(shí)間均為15.057 min，且寬纓酮對(duì)照品的二級(jí)質(zhì)譜圖與圖2B中的碎片離子完全吻合，證明該峰為寬纓酮，說明推測(cè)結(jié)果可靠。

3 結(jié) 論

本文采用UPLC-Q-TOF-MS法從東革阿里提取液中鑒定出49種化學(xué)成分，包括29種苦木素二萜、4種β-咔巴啉類生物堿、12種鐵屎米-6-酮類生物堿、3種聯(lián)苯新木脂素類及1種角鯊烯型三萜，并初步分析了其質(zhì)譜裂解規(guī)律。6種成分(寬纓酮、13α-(21)-環(huán)氧寬纓酮、東革內(nèi)酯、14,15β-Dihydroxyklaineanone、β-咔巴啉-1-丙酸和9-甲氧基-鐵屎米-6-酮)經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)以及結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)而準(zhǔn)確鑒定，其中寬纓酮、13α-(21)-環(huán)氧寬纓酮、β-咔巴啉-1-丙酸、7-甲氧基-β-咔巴啉-1-丙酸和9-甲氧基-鐵屎米-6-酮為本次東革阿里提取液中檢出含量最高的5個(gè)成分。同時(shí)，在鐵屎米-6-酮類生物堿的鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，部分異構(gòu)體的保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子均極其相似，因此取代基的連接位置不能確定，僅進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，未能最終歸屬，需進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜分析參數(shù)以獲得更詳盡的二級(jí)質(zhì)譜或通過獲取對(duì)照品進(jìn)行確證。此外，由圖1總離子流圖可見，東革阿里成分復(fù)雜，仍有很多組分(如小分子肽、氨基酸類、香豆素、甾醇等)未能歸屬，后續(xù)將進(jìn)一步深入此方面的研究。結(jié)果表明，UPLC-Q-TOF-MS可系統(tǒng)、高效、準(zhǔn)確地對(duì)東革阿里中的化學(xué)成分進(jìn)行快速定性分析，能較全面地反映東革阿里中成分的化學(xué)組成，為深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)。