黃利娜，吳光斌，匡鳳元，張 珅，陳發(fā)河

(集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

肉桂酸4-羥基化酶(cinnamic acid- 4-hydroxylase，C4H)是苯丙氨酸代謝途徑的第一個(gè)單加氧酶[1]，催化反式肉桂酸羥基化成對(duì)香豆酸[2]。單加氧酶反應(yīng)對(duì)植物脂肪酸、苯丙氨酸、生物堿和萜類化合物等多種代謝產(chǎn)物的生物合成起著重要作用。這些代謝產(chǎn)物受CYP73家族和苯丙烷途徑調(diào)控，進(jìn)而可以介導(dǎo)木質(zhì)素的合成[3]。C4H是CYP73家族的一員，在調(diào)控木質(zhì)素生物合成中起著關(guān)鍵作用[4]。C4H序列及表達(dá)模式已經(jīng)在獨(dú)行菜[5]、茶花[6]、芒果[7]、碭山酥梨[8]、桂花[9]中被報(bào)道。

蓮霧(Syzygiumsamarangense)又稱金山蒲桃、洋蒲桃，在中國和東南亞地區(qū)均有種植[10]。蓮霧果實(shí)以優(yōu)良的品質(zhì)、獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價(jià)值受到人們的喜愛，但采后呼吸代謝旺盛、組織疏松、衰老速率快，采收后如不及時(shí)進(jìn)行保鮮處理，短時(shí)間內(nèi)就會(huì)伴隨失水而發(fā)生絮狀綿軟的劣變現(xiàn)象，影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，10 μL/L 一氧化氮(nitric oxide，NO)處理可以抑制蓮霧果實(shí)糖代謝、細(xì)胞壁降解酶的活性和苯丙烷代謝途徑，從而延緩蓮霧果實(shí)絮狀綿軟化的進(jìn)程[11]。果實(shí)的軟化通常與細(xì)胞壁代謝、以木質(zhì)素合成為特征的次生代謝有關(guān)。山竹[13]和獼猴桃[14]果實(shí)中木質(zhì)素含量在貯藏期間隨果實(shí)軟化程度增加而升高。蓮霧果實(shí)采后果肉絮狀綿軟類型既不同于鱷梨、香蕉、番茄等果實(shí)，又不同于桃等一些冷敏感果實(shí)低溫下出現(xiàn)的果肉纖維化絮敗，也不同于枇杷果實(shí)低溫下發(fā)生的果肉木質(zhì)化。因此，探究蓮霧果實(shí)中木質(zhì)素合成機(jī)制對(duì)改善果實(shí)絮狀綿軟具有重要意義。有研究[15]表明，當(dāng)抑制轉(zhuǎn)基因煙草C4H酶的活性后，其木質(zhì)素含量明顯減少；同時(shí)，調(diào)控C4H轉(zhuǎn)錄水平還會(huì)影響木質(zhì)素構(gòu)成，造成S/G比值降低，而生長現(xiàn)象無異常。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，C4H在大麻葉中的高度表達(dá)導(dǎo)致了木質(zhì)素含量的增加[16]，銀杏中C4H的表達(dá)水平與木質(zhì)素的合成呈正相關(guān)[17]。然而對(duì)蓮霧果實(shí)中C4H的研究還未見報(bào)道。

本研究克隆了蓮霧果實(shí)C4H基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其結(jié)構(gòu)和功能。采用NO對(duì)蓮霧果實(shí)進(jìn)行熏蒸處理，分析采后蓮霧果實(shí)C4H在貯藏期的表達(dá)水平以及木質(zhì)素含量變化，以探究在NO處理下，C4H的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)木質(zhì)素合成的影響，為解析蓮霧果實(shí)C4H基因?qū)δ举|(zhì)素合成的作用，進(jìn)一步探究蓮霧果實(shí)木質(zhì)素合成的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用臺(tái)灣‘黑珍珠’蓮霧(Syzygiumsamarangenese[Blume]Merrill & L.M.Perry)為材料。挑選大小、表皮顏色、成熟度一致，無機(jī)械損傷和病蟲害新鮮的蓮霧果實(shí)，隨機(jī)分為2組，每組140個(gè)。將所有蓮霧果實(shí)密封在干燥器(16 L)中，通20 min N2以排出干燥器內(nèi)的O2。一組水果注入一定體積的NO氣體使干燥器內(nèi)的NO濃度達(dá)到10 μL/L，熏蒸2 h；另一組不做處理(對(duì)照)。將果實(shí)置于通風(fēng)處1 h后保鮮膜(打孔)包裝，置于溫度(4±0.5)℃、相對(duì)濕度(85±2)%條件下貯藏，貯藏期為12 d。貯藏期間每隔48 h取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定分析。

1.2 蓮霧果實(shí)C4H基因的分離

使用天根公司的植物RNA提取試劑盒提取蓮霧果實(shí)總RNA，分別用瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白質(zhì)分析儀(Eppendorf)檢測RNA的完整性和濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,MD,USA)的操作步驟，以1 μg RNA為模板生成cDNA的第一條鏈。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已測得的蓮霧果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)C4H擴(kuò)增的特異性引物(見表1)，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸2 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用凝膠提取試劑盒(Omega Bio-Tek,GA,USA)純化PCR產(chǎn)物，連接克隆載體pMD-19T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，挑選陽性克隆基因送至廈門博瑞生物公司進(jìn)行測序。

表1 研究中使用的引物

1.3 蓮霧果實(shí)C4H的生物信息學(xué)分析

利用NCBI Served Domains數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行保守域的識(shí)別。分別使用在線軟件ProtParam、Signal P 4.1 Server、TMHMM、Net Phos 3.1 Server對(duì)C4H氨基酸序列進(jìn)行序列、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)的分析。通過DNAMAN對(duì)不同植物C4H蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.4 蓮霧果實(shí)C4H表達(dá)水平分析

根據(jù)已獲得蓮霧果實(shí)C4H序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)特異性引物(見表1)，使用ABI7300熒光PCR儀進(jìn)行C4H表達(dá)水平分析，按照Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)配制qRT-PCR反應(yīng)體系，2×Super Real Pre Mix Plus，10 μL；正向引物，0.6 μL；反向引物，0.6 μL；cDNA模板，1 μL；50×ROX Reference Dye，2 μL；RNase-free ddH2O，補(bǔ)至總體系20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸31 s，40個(gè)循環(huán)。每種處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及3次技術(shù)重復(fù)。根據(jù)2-△△Ct法分析貯藏期間果實(shí)C4H的表達(dá)水平。

1.5 蓮霧果實(shí)木質(zhì)素含量的測定

采用Klason法測定蓮霧果實(shí)中木質(zhì)素含量[18]。將取自10個(gè)蓮霧的果肉10 g(記為m)研磨成勻漿，加入12 mL體積分?jǐn)?shù)70%濃硫酸，在40 ℃下振蕩水浴1 h，用200 mL蒸餾水反復(fù)沖洗勻漿至500 mL錐形瓶中，沸水浴1 h，備好已烘干至恒重的濾紙，稱取質(zhì)量記為m0，勻漿液經(jīng)布氏漏斗過濾之后，用熱水沖洗濾渣，將帶有濾渣的濾紙置于65 ℃下烘至恒重，稱重記為m1。木質(zhì)素的計(jì)算方法：木質(zhì)素/%=(m1-m0)/m×100。

2 結(jié)果

2.1 蓮霧果實(shí)C4H序列的獲得

基于前期測序得到的蓮霧果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過分析篩選到一條長度為1 849 bp的Unigene(編號(hào)為comp44506_c0)，被注釋為肉桂酸-4-羥基化酶基因。根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以蓮霧果實(shí)提取的RNA為模板，采用RT-PCR進(jìn)行C4H序列擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、特異性條帶純化回收與測序，最終獲得蓮霧果實(shí)C4H序列長1 849 bp，含有完整的開放閱讀框(open reading frame，ORF)1 518 bp，編碼505個(gè)氨基酸(見圖1)。擴(kuò)增得到的蓮霧果實(shí)C4H序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的序列一致。

2.2 蓮霧果實(shí)C4H的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy對(duì)蓮霧果實(shí)C4H的ORF編碼氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，C4H蛋白質(zhì)分子式是C2625N732O716S17，原子總數(shù)8 260，分子質(zhì)量57.985 ku，等電點(diǎn)為9.34。屬于親水性蛋白質(zhì)(總的親水性平均系數(shù)為-0.233)、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定性指數(shù)48.36)。在氨基酸的構(gòu)成中，亮氨酸(Leu)占比最多(12.1%)，其次為纈氨酸(Val)，占比為7.9%，半胱氨酸(Cys)占比最少，僅為0.6%。該基因編碼的氨基酸中，正電荷氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為73，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為62。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖2所示，C4H蛋白質(zhì)含有P450(cytochrome P450)和PLN02394 (trans-cinnamate 4-monooxygenase)兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。C4H催化位點(diǎn)殘基包括I109、K113、V118、F220、E301、N302、I303、V305、A306、T310、R366、R368、A370、I371、P372、L374、V375、P376、H377、K484、F488、L490。這些催化位點(diǎn)分布在5個(gè)特殊的底物結(jié)合區(qū)域，包括SRSl、SRS2、SRS4、SRS5和SRS6(見圖1)。利用NetPhos 2.0預(yù)測蓮霧果實(shí)C4H蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)含有28個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括14個(gè)絲氨酸(Ser)、8個(gè)蘇氨酸(Thr)和6個(gè)酪氨酸(Tyr)(見圖3)。

進(jìn)一步對(duì)蓮霧果實(shí)C4H結(jié)構(gòu)功能研究，采用Signal P 4.1 Server 對(duì)氨基酸序列信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖4顯示，其多肽鏈第29號(hào)賴氨酸(Lys)殘基具有最高的原始剪切位點(diǎn)分值0.246，第11號(hào)亮氨酸(Leu)殘基具有最高的綜合剪切位點(diǎn)分值0.213，第5號(hào)亮氨酸(Leu)殘基具有最高的信號(hào)肽分值0.492，表明蓮霧果實(shí)C4H不存在信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，不具有信號(hào)肽。利用TMHMM對(duì)蓮霧C4H編碼的氨基酸序列跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，整條多肽鏈不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不是膜上的受體或者定位于膜上(見圖5)。

利用DNAMAN軟件對(duì)不同種類植物C4H蛋白質(zhì)進(jìn)行多重比對(duì)，分析C4H蛋白質(zhì)的相似性，結(jié)果如圖6顯示。可見，蓮霧果實(shí)C4H蛋白質(zhì)與已研究報(bào)道的橄欖、梨、芒果、銀杏C4H蛋白質(zhì)具有較高的相似性，進(jìn)一步證明了從蓮霧果實(shí)中獲得的基因是C4H基因。之前的研究還證明，芒果、梨、銀杏的C4H表達(dá)水平與木質(zhì)素的合成具有正相關(guān)關(guān)系，是木質(zhì)素調(diào)控的關(guān)鍵基因，進(jìn)而推斷蓮霧果實(shí)C4H可能也具有此功能。

2.3 NO處理下蓮霧果實(shí)C4H表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)蓮霧果實(shí)C4H表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7所示，在貯藏期間，采后蓮霧果實(shí)C4H的表達(dá)水平逐漸增加。對(duì)照果實(shí)C4H表達(dá)水平在貯藏前兩天略有上升，隨后迅速上升；而NO處理組果實(shí)C4H的表達(dá)水平變化趨勢相同，但NO處理組果實(shí)C4H的表達(dá)水平低于對(duì)照組。顯著性分析表明，NO處理組蓮霧果實(shí)C4H的表達(dá)水平在貯藏第2～12 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見，NO可以抑制采后蓮霧果實(shí)C4H的轉(zhuǎn)錄水平。

2.4 NO處理下木質(zhì)素含量變化的分析

圖8顯示，采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素含量隨貯藏時(shí)間的延長而增加。對(duì)照組果實(shí)木質(zhì)素含量從第0～4天逐漸升高，貯藏第4～12天木質(zhì)素含量迅速上升；而NO處理組果實(shí)中木質(zhì)素含量從第0～2天緩慢上升，然后逐漸增加。顯著性分析表明，在果實(shí)貯藏第2～12天，NO處理組果實(shí)木質(zhì)素含量顯著低于對(duì)照果實(shí)(P<0.05)。由此可見，使用NO處理采后蓮霧果實(shí)，可顯著抑制采后蓮霧果實(shí)木質(zhì)素含量積累。

3 討論

苯丙烷類代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑之一，此途徑以苯丙氨酸為底物，在一系列酶的催化作用下，合成黃酮、木質(zhì)素、香豆素等多種次生代謝產(chǎn)物[19]。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的主要成分，與纖維素一起參與植物根莖的生長以及影響一些水果的軟化[13]。其他次生代謝產(chǎn)物如黃酮醇、花青素、異黃酮以及其他類黃酮物質(zhì)在植物生長、抗病性和抗應(yīng)激性中發(fā)揮重要作用[19]。C4H是植物苯丙烷代謝通路中第1個(gè)單氧化酶，該酶在植物細(xì)胞中的含量可以影響木質(zhì)素等多種次生代謝物質(zhì)的合成[1]。因此，在不同植物中鑒定出C4H將對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)或調(diào)控果蔬品質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵作用。C4H已在多種植物中被鑒定，但在蓮霧果實(shí)中還未有報(bào)道，本研究采用qRT-PCR技術(shù)從蓮霧果實(shí)中獲得C4H基因。

C4H蛋白質(zhì)含有細(xì)胞色素P450和反式肉桂酸-4-單加氧酶結(jié)構(gòu)域[2,20]。這兩個(gè)特征域在蓮霧果實(shí)C4H蛋白質(zhì)中均被預(yù)測到，表明克隆得到的基因?yàn)樯忟F果實(shí)的C4H基因。蓮霧C4H蛋白質(zhì)中鑒定出5個(gè)特殊的底物結(jié)合區(qū)域(見圖1)，是此蛋白質(zhì)的功能區(qū)域。C端的SRS5、SRS6和SRS4是以芳香環(huán)為底物的結(jié)合位點(diǎn)，N端的SRS4、SRS1和SRS2是以脂肪鏈為底物的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域[22]。蓮霧果實(shí)C4H所含的結(jié)構(gòu)域表明，它是具有催化功能的C4H/CYP73A5家族成員。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，其磷酸化部位主要包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)[23]。磷酸化后可改變蛋白質(zhì)的活性，這種改變在植物生理生化應(yīng)答反應(yīng)過程中起重要作用[24]。在蓮霧果實(shí)C4H蛋白質(zhì)中觀察到15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些預(yù)測的位點(diǎn)在催化活性中起關(guān)鍵作用。蓮霧果實(shí)C4H蛋白質(zhì)與已研究的橄欖、梨、芒果、銀杏C4H蛋白質(zhì)具有較高的相似性，說明C4H蛋白在植物間具有較高的保守性以及推測這些蛋白質(zhì)的功能也具有相似性。

已有研究[25]表明，木質(zhì)素的積累量與C4H的表達(dá)水平有著密切的關(guān)系，如刺梨木質(zhì)素含量的變化趨勢和C4H的變化趨勢相同，兩者表現(xiàn)出顯著正相關(guān)關(guān)系；Wang等[26]發(fā)現(xiàn)C4H表達(dá)水平的上調(diào)抑制蘋果中木質(zhì)素的合成。在采后蓮霧果實(shí)貯藏期間，C4H的表達(dá)水平和木質(zhì)素積累量逐漸增加，相關(guān)性分析顯示，蓮霧果實(shí)C4H表達(dá)水平與木質(zhì)素含量相關(guān)性達(dá)0.972，呈極顯著正相關(guān)，表明蓮霧C4H與木質(zhì)素合成密切相關(guān)。適宜濃度的NO能夠抑制細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性，延緩了果實(shí)軟化與衰老，從而維持采后果蔬的貯藏品質(zhì)[27]。本研究中10 μL·L-1NO顯著抑制了蓮霧果實(shí)C4H的表達(dá)水平和木質(zhì)素含量(P<0.05)。由此可見，外源NO處理可能是通過抑制C4H的轉(zhuǎn)錄水平來抑制木質(zhì)素的合成速度，從而延緩蓮霧果實(shí)中心絮狀綿軟的進(jìn)程，為將NO處理用于采后蓮霧果實(shí)品質(zhì)保持提供理論依據(jù),也為揭示C4H基因調(diào)控蓮霧果實(shí)木質(zhì)素合成機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。