張鶴，張沄，王宋平

支氣管哮喘（哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病。氧化-抗氧化機制失衡是支氣管哮喘的發(fā)病機制之一［1］。其中活性氧（ROS）可促進氣道高反應(yīng)、黏液高分泌等，導(dǎo)致氣道重塑［2-3］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）通過誘導(dǎo)膠原蛋白的合成和成纖維細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致氣道基底膜增厚，從而引起氣道重塑［4］。而TGF-β1同時具有調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生長和分化等功能，可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速纖維化進程［5-6］。近年來1，25-二羥維生素D3［1，25-（OH）2D3］在支氣管哮喘方面的研究成為熱點。相關(guān)研究表明，1，25-（OH）2D3對哮喘的氣道炎癥及氣道重塑有抑制作用，1，25-（OH）2D3可以通過抑制TGF-β1/Smads通路，從而改善氣道重塑［7］。同時1，25-（OH）2D3也具有抗氧化應(yīng)激作用，通過減少ROS生成，調(diào)控哮喘氣道氧化應(yīng)激水平，從而達到抗炎和抗氧化作用［8］。但目前1，25-（OH）2D3對于支氣管哮喘通過TGF-β1/（Smad2/3）通路調(diào)節(jié)ROS的機制尚不明確。本研究通過構(gòu)造慢性哮喘小鼠模型，探討1，25-（OH）2D3對哮喘小鼠氣道重塑和對氧化應(yīng)激的影響及其機制，以期為哮喘臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）實驗動物。雌性SPF級Balb/c小鼠24只，周齡6～8周，體質(zhì)量18～24 g，購自重慶萊彼特生物科技有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動物房，恒溫25℃，清潔飼料喂養(yǎng)，自由飲食和飲水，12 h晝夜交替。（2）主要藥品與試劑。卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國Sigma公司，氫氧化鋁粉劑購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，1，25-（OH）2D3粉劑購自阿拉丁公司，無水乙醇購自成都市科隆化學(xué)品有限公司，自制密閉紙箱30 cm×30 cm×20 cm，超聲霧化器購自東莞市健寶電子科技有限公司，TGF-β1和Smad2/3抗體分別購自武漢三鷹公司和CST公司。

1.2 哮喘模型的制備 參照文獻［9］，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)1周后24只小鼠隨機分為正常組（A組）、哮喘組（B組）、1，25-（OH）2D3+哮喘組（C組）。B組和C組分別于第0、7、14天腹腔注射0.5 mL致敏液（10μg卵清蛋白與2 mg氫氧化鋁制劑），而A組則注射等量的生理鹽水。于第21天將B、C組小鼠分別置于封閉紙箱中，以2.5%OVA溶液霧化30 min，其中第21～27天每天霧化1次，第28～77天隔天霧化1次。而A組給予等量的生理鹽水霧化。C組在第21天每次霧化激發(fā)前30 min腹腔注射100 ng 1，25-（OH）2D3溶液。A組及B組給予等量的生理鹽水進行腹腔注射。整個實驗過程持續(xù)至少77 d。

1.3 肺組織病理形態(tài)檢測 各組小鼠于末次激發(fā)后24 h內(nèi)用戊巴比妥麻醉并處死。取出右肺置于4%甲醛溶液中外固定48 h，常規(guī)制備病理石蠟切片，用于HE、PAS染色及Masson染色，免疫熒光檢測小鼠氣道ROS。

1.4 氣道重塑相關(guān)指標(biāo)測量 Masson染色觀察氣道膠原沉積程度，運用計算機圖像分析軟件Image-Pro Plus測量氣道膠原沉積的面積，分別測量支氣管基底膜周徑（Pbm）、氣管內(nèi)管壁面積（WAi）、平滑肌層面積（WAm），并用Pbm將測量值標(biāo)準(zhǔn)化，分別代表支氣管內(nèi)壁厚度（WAi/Pbm），平滑肌層厚度（WAm/Pbm），以衡量氣道重塑程度。

1.5 各組小鼠肺組織中ROS水平檢測 將小鼠處死后取出肺組織，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）稍洗，冷凍，將冷凍后的肺組織用冰凍切片機，切片。制片后，滴加稀釋好的探針溶液，37℃孵育30 min，PBS洗去多余探針溶液，抗體孵育后用二脒基苯基吲哚（DAPI）染色，用抗熒光淬滅劑封片，用熒光顯微鏡（×200）觀察并拍照。

1.6 肺組織中TGF-β1及Smad2/3的表達 提取小鼠肺組織勻漿總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、化學(xué)發(fā)光。檢測肺組織中TGF-β1及Smad2/3的表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理形態(tài)改變

2.1.1 HE染色 A組小鼠可見氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，未見明顯破壞。B組可見大量炎性細(xì)胞，氣道管腔分泌物，支氣管壁增厚，支氣管平滑肌肥大，黏膜下水腫。C組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)相對完整，仍可見少許氣道上皮脫落，病理改變較B組減輕。見圖1。

2.1.2 PAS染色 A組小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，未見支氣管上皮杯狀細(xì)胞，氣道管腔光滑，未見黏液分泌；與A組比較，B組小鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌增加，部分管腔黏液栓形成，PAS染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加；C組較B組支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌減少，PAS染色陽性細(xì)胞數(shù)減少，但較A組增多，見圖2。

2.1.3 Masson染色 A組氣管腔氣道上皮光滑，氣道上皮有少許膠原沉積，B組氣道上皮下膠原沉積明顯增多，病理改變明顯，而C組較B組上述改變減輕，但仍較A組多，見圖3。

2.1.4 各組膠原沉積面積、壁厚度和平滑肌厚度比較 與A組比較，B組膠原沉積面積比、支氣管管壁厚度和平滑肌厚度明顯增加，C組膠原沉積面積比、管壁厚度和平滑肌厚度較B組減少，但仍較A組增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 comparison of bronchial wall thickness,smooth muscle thickness and collagen deposition area ratio between three groups表1 3組支氣管膠原沉積面積比、管壁厚度和平滑肌厚度比較 （n=3，x±s）

2.2 各組肺組織ROS、TGF-β1、Smad2/3蛋白的表達水平比較 正常情況下，A組細(xì)胞中產(chǎn)生低水平的ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白也呈低表達，B組較A組ROS、TGF-β1、Smad2/3蛋白的表達水平明顯升高；與B組相比，C組ROS，TGF-β1、Smad2/3蛋白的表達降低，但仍較A組升高（P＜0.05），見圖 4、5，表2。

Fig.5 The electroporesis of TGF-β1 and smad2/3 protein expressions in lung tissues of mice in three groups圖5 3組小鼠肺組織中TGF-β1和Smad2/3蛋白表達電泳圖

Tab.2 Comparison of TGF-β1,Smad2/3 and ROS expressions between three groups表2 3組TGF-β1、Smad2/3及ROS表達比較 （n=3，x±s）

3 討論

1，25-（OH）2D3是體內(nèi)最重要的維生素D的活性代謝產(chǎn)物，可通過參與先天性免疫過程和適應(yīng)性免疫過程發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用［10］。Kim等［11-12］發(fā)現(xiàn)，1，25-（OH）2D3可能通過調(diào)控RhoA/Rho激酶信號通路、抑制核因子-κB（NF-κB）、TGF-β1/Smads通路調(diào)節(jié)哮喘等過敏性疾病。1，25-（OH）2D3不僅具有抗炎的作用，也可通過減少ROS生成調(diào)控氧化應(yīng)激水平，從而達到抗氧化作用［13］。但目前1，25-（OH）2D3對于哮喘小鼠通過TGF-β1/（Smad2/3）調(diào)節(jié)ROS的機制少有報道。

本研究結(jié)果顯示，與哮喘組比較，給予1，25-（OH）2D3治療后氣道炎性細(xì)胞及管腔分泌物明顯減少，氣道上皮結(jié)構(gòu)相對完整，膠原纖維沉積減少，ROS免疫熒光強度降低，TGF-β1及Smad2/3表達減少，提示1，25-（OH）2D3可改善支氣管哮喘氣道炎癥、氣道重塑及氧化應(yīng)激水平。TGF-β1/Smads通路是哮喘發(fā)病機制中主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在哮喘氣道重塑中起關(guān)鍵作用，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、纖維化等，影響膠原沉積及纖維化的形成，增加小氣道狹窄［14-15］。本研究結(jié)果顯示，哮喘狀態(tài)下小鼠的TGF-β1和Smad2/3表達明顯增加，而1，25-（OH）2D3治療后，TGF-β1和Smad2/3的表達減少，提示1，25-（OH）2D3能在一定程度上抑制TGF-β1和Smad2/3的表達，表明1，25-（OH）2D3調(diào)控哮喘氣道重塑的機制可能是通過抑制TGF-β1/（Smad2/3）通路實現(xiàn)的。氧化應(yīng)激參與哮喘發(fā)生發(fā)展過程，而ROS可直接作用并破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞死亡等，促進炎癥反應(yīng)，并且進一步促進氣道高反應(yīng)、黏液高分泌及纖維化［16］。另外本研究顯示，哮喘狀態(tài)下小鼠的ROS表達明顯增加，而1，25-（OH）2D3治療后，ROS的表達減少，提示1，25-（OH）2D3能在一定程度上抑制ROS的表達，表明1，25-（OH）2D3可能通過抑制ROS的表達從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。Demir等［17］也證實，1，25-（OH）2D3可以抑制ROS的表達，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

TGF-β1參與包括哮喘在內(nèi)的多種氣道慢性炎癥疾病，可通過多種機制促進哮喘氣道重塑，其中包括刺激肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等合成ROS［18］。ROS是誘導(dǎo)纖維化的重要介質(zhì)，能夠促進膠原蛋白的合成，是TGF-β1和Smad2/3作用于纖維化的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，其能夠通過激活TGF-β1/（Smad2/3）通路，從而進一步促進氣道重塑［19］。本研究結(jié)果顯示，哮喘狀態(tài)下小鼠TGF-β1和ROS表達均明顯升高，這與Tyagi等［20］研究結(jié)果一致，提示TGF-β1可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速纖維化進程，考慮原因可能為TGF-β1能夠通過上調(diào)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）的活性，增強細(xì)胞內(nèi)ROS的合成，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，使氣道反應(yīng)性升高，黏液分泌增高，血管通透性增加，進而加速器官纖維化，促進氣道重塑［21］。而1，25-（OH）2D3治療后，TGF-β1和ROS的表達減少，提示1，25-（OH）2D3能夠在一定程度上抑制TGF-β1和ROS的表達，表明1，25-（OH）2D3可能通過抑制TGF-β1的表達，從而下調(diào)ROS，達到抑制哮喘氣道重塑及氧化應(yīng)激水平的作用。

綜上所述，1，25-（OH）2D3可以抑制哮喘氣道重塑及氧化應(yīng)激水平。同時，1，25-（OH）2D3可能通過抑制TGF-β1/（Smad2/3）的表達，從而減少ROS水平，達到調(diào)節(jié)小鼠氣道重塑及氧化應(yīng)激的作用。但相關(guān)機制尚未完全明確，還需進一步完善實驗明確具體機制。

（圖1～4見插頁）