毛楠，林定彪，馬欣，陳鴻禧，周琬秋，王少清△

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）是威脅人類健康的重大疾病之一，已經(jīng)成為全球性公共健康問(wèn)題，其發(fā)病率、致殘率和病死率高，給個(gè)人、家庭及社會(huì)造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。醛固酮（aldosterone，ALDO）是CKD進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵遞質(zhì)，直接參與腎小管損傷及腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，ALDO可促進(jìn)大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的釋放，通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞發(fā)生自噬［1］。大量研究證實(shí)，高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）與細(xì)胞自噬存在密切的關(guān)系［2］。HMGB1作為一種新型的炎性細(xì)胞因子，廣泛分布于淋巴組織、心、肝、肺、脾、腎、腦等組織中，其本身很少或者無(wú)促炎癥活性，但當(dāng)它與炎癥介質(zhì)結(jié)合時(shí)，可激活和趨化炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)大量炎癥因子的分泌和釋放，進(jìn)而激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)［3］。筆者推測(cè)HMGB1可能是ALDO誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞自噬的重要中介因素。本研究擬采用ALDO致腎小管上皮細(xì)胞損傷模型，探討HMGB1在ALDO誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞自噬中的作用，為慢性腎臟病的防治提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）購(gòu)自中科院干細(xì)胞庫(kù)/干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，課題組既往研究已驗(yàn)證該細(xì)胞的生物學(xué)特性［1］。

1.1.2 藥物與試劑 醛固酮、N-乙酰半胱氨酸（美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；兔抗大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β多克隆抗體、兔抗大鼠LC3B多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（美國(guó)CST公司）；兔抗HMGB1多克隆抗體，兔抗p62多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）活性氧熒光探針試劑盒（上海碧云天生物有限公司）。

1.1.3 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；無(wú)菌操作臺(tái)（德國(guó)Heraeus公司）；流式細(xì)胞儀（FACSAria，美國(guó)BD Bioscience公司）；冷凍離心機(jī)（德國(guó)SORVALL-fresco公司）；高速低溫臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；垂直/水平電泳槽（上海天能）；水平電泳儀、Trans-blot電轉(zhuǎn)移槽、圖像采集與分析儀（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，改為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓24 h，使其生長(zhǎng)同步化后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ROS檢測(cè) 將密度為1.0×105個(gè)/孔的NRK-52E細(xì)胞接種在6孔板中過(guò)夜，分為Control組、ALDO組（加入ALDO 10 nmol/L）、HMGB1抗體組（加入1 mg/L HMGB1）、IgG組（加入1 mg/L IgG）、ALDO+HMGB1抗體組（1 mg/L HMGB1抗體預(yù)處理1 h，再加入10 nmol/L ALDO）和陽(yáng)性對(duì)照組（加入活性氧供氫體Rosup100μmol/L），以上各組均干預(yù)24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。取10μL DCFH-DA探針，用20 mL無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為5μmol/L。收集上述各組干預(yù)24 h后的細(xì)胞，懸浮于1 mL稀釋好的DCFH-DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min（每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸）；用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA；應(yīng)用流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞的ROS水平。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的2'，7'-二氯熒光素（2',7'-Dichlorofluorescein,DCF），綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比，即細(xì)胞內(nèi)ROS水平=DCF熒光強(qiáng)度。

1.2.3 Western blot檢測(cè)IL-1β蛋白的表達(dá) 此部分實(shí)驗(yàn)設(shè)Control組、ALDO組（加入10 nmol/L ALDO）、NAC組（加入50μmol/L NAC）、NAC+ALDO組（50μmol/L NAC預(yù)處理NRK-52E細(xì)胞1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各組均干預(yù)24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞后提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。將40μg總蛋白提取液與4×SDS緩沖液混勻，100℃加熱變性8 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜；TBST緩沖液漂洗8 min×3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗5 min×3次，避光加入ECL發(fā)光劑，X線常規(guī)顯影、定影并進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，分為Control組和ALDO組（10 nmol/L），干預(yù)24 h后提取蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。將40μg總蛋白提取液與4×SDS緩沖液混勻，100℃加熱變性8 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗HMGB1多克隆抗體（1∶1 000），4℃過(guò)夜；TBST緩沖液漂洗8 min×3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST緩沖液清洗5 min×3次，避光加入ECL發(fā)光劑，X線常規(guī)顯影、定影并進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 阻斷HMGB1對(duì)ALDO誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞自噬的影響 此部分實(shí)驗(yàn)設(shè)為Control組、ALDO組（加入10 nmol/L ALDO）、HMGB1抗體組（加入1 mg/L HMGB1抗體）和ALDO+HMGB1抗體組（1 mg/L HMGB1抗體預(yù)處理1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各組均干預(yù)24 h，參照1.2.4中的步驟，Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有結(jié)果均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料用x±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，獨(dú)立的多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩因素水平的樣本均數(shù)比較采用析因方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醛固酮可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，ALDO組、ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平明顯升高（P＜0.05）；與ALDO組比較，HMGB1抗體組、IgG組和ALDO+HMGB1抗體組ROS水平顯著降低（P＜0.05），Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與HMGB1抗體組比較，ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與IgG組比較，ALDO+HMGB1抗體組和Rosup組ROS水平升高（P＜0.05）；與Rosup組比較，ALDO+HMGB1抗體組ROS水平降低（P＜0.05）；Control組、HMGB1抗體組和IgG組組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即ROS水平：Rosup組＞ALDO組＞ALDO+HMGB1抗體組＞HMGB1抗體組/Control組/IgG組，見(jiàn)表1、圖1。

Tab.1 Effects of different intervention conditions on ROS levels in NRK-52E cells表1 各組不同干預(yù)條件對(duì)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響 （x±s）

Fig.1 Effects of different intervention conditions on ROS level in NRK-52E cells圖1 各組不同干預(yù)條件對(duì)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.2 ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響 由表2析因方差分析結(jié)果可得，PALDO＜0.05，即ALDO可上調(diào)IL-1β蛋白的表達(dá)；PNAC＞0.05，即NAC對(duì) IL-1β 蛋白的表達(dá)無(wú)影響；PALDO×NAC＜0.05，即ALDO與NAC兩因素間存在交互作用，且對(duì)IL-1β蛋白表達(dá)有抑制作用，見(jiàn)表2、圖2。

Tab.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β in NRK-52E cells表2ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響（n=3，x±s）

Fig.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β protein in NRK-52E cells圖2 ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

2.3 ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)的影響 與Control組（0.33±0.13）比較，ALDO組（0.56±0.05）HMGB1蛋白的表達(dá)上調(diào)（n=3，t=2.841，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Fig.3 Effects of aldosterone on HMGB1 protein expression in NRK-52E cells圖3ALDO對(duì)NRK-52E細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響

2.4 阻斷HMGB1改善ALDO誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞自噬 Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，ALDO組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。與ALDO組比較，ALDO+HMGB1抗體組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)降低、p62蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），Beclin-1蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HMGB1組相比，ALDO+HMGB1抗體組Beclin-1蛋白的表達(dá)增加（P＜0.05）。在Control組、HMGB1抗體組、ALDO+HMGB1抗體組間LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Control組、HMGB1抗體組間Beclin-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖4。

Tab.3 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells表3 阻斷HMGB1對(duì)ALDO誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞自噬的影響 （n=3，x±s）

Fig.4 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells圖4 阻斷HMGB1對(duì)ALDO誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞自噬的影響

3 討論

慢性腎臟病是當(dāng)代全球危害人類健康的重大疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ALDO是CKD進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵遞質(zhì)，可獨(dú)立于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）直接參與腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程［4］。ALDO促發(fā)的炎癥反應(yīng)與線粒體功能障礙所致的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)量有關(guān)，但其確切機(jī)制尚未闡明［5-7］。在骨骼肌缺血/再灌注損傷研究中發(fā)現(xiàn)，ALDO可誘導(dǎo)HMGB1分泌增加，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，致使遠(yuǎn)隔心肌組織損傷［8］。Abdulmahdi等［9］在膿毒癥致人腎近端小管（HK-2）細(xì)胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與了HMGB1的釋放。對(duì)于HMGB1在ALDO誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬中的作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，10 nmol/L ALDO處理NRK-52E細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平較Control組明顯升高；ALDO+HMGB1抗體組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平較ALDO組明顯降低，上述結(jié)果提示HMGB1參與了ALDO促發(fā)的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白，可以通過(guò)主動(dòng)分泌和被動(dòng)釋放兩種方式進(jìn)入胞外，除了在免疫和炎性過(guò)程中發(fā)揮作用外，還可作為調(diào)節(jié)因子影響細(xì)胞自噬［10］。胞漿內(nèi)的HMGB1與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1結(jié)合，激活自噬。自噬發(fā)生時(shí)，胞漿中的LC3-Ⅰ發(fā)生斷裂，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ并定位在自噬小體膜上；而泛素結(jié)合蛋白p62則可直接偶聯(lián)在LC3上，參與自噬體的構(gòu)成［11］。有研究報(bào)道，HMGB1可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)上調(diào)，而抑制HMGB1后上述蛋白表達(dá)明顯降低［12］。而本研究中，10 nmol/L ALDO刺激NRK-52E細(xì)胞后，HMGB1和IL-1β蛋白的表達(dá)均較Control組增加，同時(shí)細(xì)胞自噬也增加（Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)上調(diào)，p62的表達(dá)下調(diào)）。經(jīng)50μmol/L NAC預(yù)處理NRK-52E細(xì)胞后，IL-1β蛋白的表達(dá)較ALDO組明顯下調(diào)；而給予1 mg/L HMGB1抗體預(yù)處理后，LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)較ALDO組明顯降低、p62蛋白的表達(dá)較ALDO組明顯增加。上述研究結(jié)果表明，HMGB1可能是通過(guò)刺激IL-1β的釋放，加重氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和完整性。

綜上所述，ALDO可能通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增加HMGB1分泌，刺激炎癥因子IL-1β的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生；抑制HMGB1的釋放可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。HMGB1可能作為ALDO誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的新靶點(diǎn)，在慢性腎臟病的治療中發(fā)揮重要作用，后期將深入研究其具體的分子機(jī)制。