郭東貴,俸婷婷,張 敏,王慧娟,*

(1.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550003;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

骨質(zhì)疏松癥是基于骨重建過(guò)程中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的協(xié)作和平衡被打破,使骨吸收大于骨形成,從而引發(fā)骨質(zhì)疏松的一種骨代謝性疾病[1-2]?；诂F(xiàn)代醫(yī)藥研究的發(fā)展,從細(xì)胞水平上研究成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡與協(xié)作,探尋抑制破骨細(xì)胞吸收和/或促進(jìn)成骨細(xì)胞形成的活性物質(zhì),成為開(kāi)發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物和功能性食品的重要途徑。

保健類食品在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,因其具有毒副作用小、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)受到人們?cè)絹?lái)越多的研究和關(guān)注[3-5],并且,利用中醫(yī)保健理論,將民族藥開(kāi)發(fā)成保健食品用于預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的研究也逐步深入[6-7]。桑白皮為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥根皮,性甘寒,歸肺經(jīng),具有瀉肺平喘、利水消腫之功效[8]?，F(xiàn)代藥理研究表明,桑白皮還具有降糖、降脂、抗炎等作用[9-11]。在中醫(yī)臨床與研究中,桑白皮常與其他藥材組成復(fù)方制劑,用于防治肥胖及糖尿病等引起的骨質(zhì)疏松[12-14],表明其具有抗骨質(zhì)疏松的潛力。但目前未見(jiàn)桑白皮單獨(dú)用于抗骨質(zhì)疏松方面的研究報(bào)道。

本文采用體外細(xì)胞模型,研究桑白皮不同提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖及破骨細(xì)胞形成的影響,旨在探討桑白皮抗骨質(zhì)疏松的活性作用,為其保健功能的研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)胞株MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14) 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);桑白皮藥材 貴州省藥材公司;摩魯新L對(duì)照品 實(shí)驗(yàn)室自制(經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、MS和HPLC檢查,均為單一組分。HPLC歸一化法測(cè)定,純度為99.6%);α-MEM液體培養(yǎng)基 HyClone公司;α-MEM干粉培養(yǎng)基 Gibico公司;二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT) 北京Solarbio公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒、1α,25-(OH)2VitD3美國(guó)Sigma公司;青鏈霉素混合液 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

LEICA DMi8型倒置熒光相差顯微鏡 徠卡;SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;VARIOSKAN LUX型酶標(biāo)儀、EVOLUTION 201型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、LOCATOR JR PLUS型液氮罐、3111型CO2培養(yǎng)箱 Thermo Scientific;YXQ-LS-50SSII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;BP201S型電子天平 賽多利斯有限公司;LGJ-12型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑白皮提取物的制備

1.2.1.1 桑白皮水提物 將桑白皮藥材粉碎,稱取100 g,按照前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的料液比(1∶10 g/mL)加入蒸餾水,加熱至微沸,回流提取3次,合并提取液,過(guò)濾,濃縮干燥,即得水提物W。

1.2.1.2 桑白皮醇提物 稱取100 g桑白皮粉末,按照前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的料液比(1∶40 g/mL)加入70%乙醇,65 ℃回流提取3次,合并提取液,過(guò)濾,濃縮干燥,即得醇提物E。

1.2.1.3 桑白皮純化提取物R 按“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備桑白皮醇提液,過(guò)濾,濃縮后通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂進(jìn)一步純化,收集70%乙醇洗脫液[15],濃縮干燥,即得提取物R。

1.2.1.4 桑白皮純化提取物PA 將“1.2.1.3”項(xiàng)下經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化后的產(chǎn)物,再經(jīng)聚酰胺柱層析進(jìn)行分離純化,收集50%乙醇洗脫液[15],濃縮干燥,即得提取物PA。

1.2.2 桑白皮提取物中總黃酮的含量測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取摩魯新L對(duì)照品20.3 mg,加乙醇制成每1 mL含摩魯新L 81.2 μg的對(duì)照品溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置10 mL量瓶中,各加3% AlCl3溶液0.5 mL,再加乙醇至刻度,搖勻,放置30 min,以不加顯色劑的樣品溶液為空白,在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。

1.2.2.3 樣品測(cè)定 取桑白皮提取物適量(W和E各0.05 g,R和PA各0.02 g),精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入乙醇50 mL,稱定重量,加熱回流2 h,放冷,再稱定重量,用乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,照“1.2.2.2”項(xiàng)下方法,自“加3% AlCl3溶液0.5 mL”起,依法測(cè)定吸光度,同時(shí)精密量取供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻,作為空白溶液。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出供試品溶液中摩魯新L的含量,并計(jì)算樣品中總黃酮的含量(以摩魯新L計(jì))。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組:培養(yǎng)孔中接種與實(shí)驗(yàn)組等量的細(xì)胞,加入含1‰ DMSO的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

調(diào)零組:培養(yǎng)孔中不接種細(xì)胞,只加入含1‰ DMSO的培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)組:各提取物均設(shè)置3個(gè)劑量組。W和E:5、10、20 mg/L;R和PA:10、20、50 mg/L。

1.2.4 桑白皮提取物對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響 從出生48 h以內(nèi)乳兔后肢的股骨和脛骨中獲取骨髓細(xì)胞懸液,過(guò)200目細(xì)胞篩,計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2×106個(gè)/mL,接種于24孔板中培養(yǎng),每孔500 μL。24 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,PBS輕洗1次,然后加入桑白皮提取物W、E、R、PA或空白破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(α-MEM全培養(yǎng)基中加入10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3)繼續(xù)培養(yǎng),以后每隔2 d換一次液。培養(yǎng)8 d后棄培養(yǎng)液,PBS輕洗后進(jìn)行TRAP染色,具體染色方法參照抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒中所附說(shuō)明書(shū)。染色后置于顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)孔內(nèi)的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.5 桑白皮提取物對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響 將成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Subclone 14消化,制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至5×104cell/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后吸棄各孔培養(yǎng)液,更換為新配制的含藥α-MEM全培養(yǎng)基或空白α-MEM全培養(yǎng)基(含10% FBS和1%的青-鏈霉素),置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μL 5.0 mg/mL MTT溶液,4 h后吸棄孔內(nèi)液體,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min充分溶解結(jié)晶物,于490 nm下測(cè)定吸光度值,并計(jì)算增殖率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

結(jié)果如圖1所示,對(duì)照品溶液在8.12～48.72 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系:y=0.011x+0.0071(R2=0.9991)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 桑白皮提取物中總黃酮的含量

如表1所示,桑白皮醇提物E中總黃酮的含量要高于水提物W。醇提物E經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂富集后黃酮含量有所提高,再經(jīng)聚酰胺柱層析進(jìn)一步純化,總黃酮含量可達(dá)37.23%。

表1 桑白皮提取物中總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3 桑白皮提取物對(duì)破骨細(xì)胞的活性作用

破骨細(xì)胞作為骨結(jié)構(gòu)中的重要細(xì)胞,是一類末端分化的多核細(xì)胞,不能增殖傳代[16-17]。骨髓細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可分化成破骨細(xì)胞,TRAP酶是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶,通過(guò)TRAP染色陽(yáng)性計(jì)數(shù),可以反映出破骨細(xì)胞的數(shù)量[18]。通過(guò)研究桑白皮提取物對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響,可提示其抗骨質(zhì)疏松的活性。

由前期初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)提取物W和E劑量達(dá)50 mg/L、R和PA劑量達(dá)100 mg/L時(shí),培養(yǎng)孔中出現(xiàn)空曠區(qū)域,說(shuō)明藥物濃度較高時(shí)對(duì)骨髓細(xì)胞有一定毒性,因此降低劑量進(jìn)一步研究,結(jié)果見(jiàn)表2～表5和圖2。

圖2 各組破骨細(xì)胞的TRAP染色圖片(×50)

表2 水提物W對(duì)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響(n=5)

表3 醇提物E對(duì)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響(n=5)

表4 提取物R對(duì)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響(n=5)

表5 提取物PA對(duì)TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的影響(n=5)

由圖2可知,各空白對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)量較多,且破骨細(xì)胞體積較大。與空白組相比,桑白皮各提取物高劑量組的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著減少(P<0.01),且破骨細(xì)胞體積相對(duì)較小。由表2～表5的結(jié)果可知,水提物W(20 mg/L)、醇提物E(10、20 mg/L)、純化提取物R(20、50 mg/L)和純化提取物PA(10、20、50 mg/L)均能顯著或極顯著抑制破骨細(xì)胞形成(P<0.05或P<0.01)。對(duì)于桑白皮粗提物來(lái)說(shuō),醇提物E抑制破骨細(xì)胞作用強(qiáng)于水提物W,而醇提物E的黃酮含量高于水提物W,表明桑白皮粗提物對(duì)破骨細(xì)胞的活性作用與黃酮含量有關(guān),隨黃酮含量增加而增強(qiáng)。桑白皮醇提物進(jìn)一步純化后,純化提取物PA抑制破骨細(xì)胞作用明顯強(qiáng)于純化提取物R,活性作用也隨黃酮含量增加而增強(qiáng)。

2.4 桑白皮提取物對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的活性作用

MC3T3-E1 Subclone 14是從小鼠顱頂骨中分離培養(yǎng)而來(lái)的成骨前體細(xì)胞,是體外研究成骨細(xì)胞常用的細(xì)胞模型。本文通過(guò)MTT法考察桑白皮提取物對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞活性的影響,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6～表9。

表6 水提物W對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞增殖的影響

表7 醇提物E對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞增殖的影響

表8 提取物R對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞增殖的影響

表9 提取物PA對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞增殖的影響

研究表明,四種提取物的各劑量組均能促進(jìn)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的增殖,與空白組相比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中,醇提物E各劑量組增殖率均稍大于同劑量組的水提物W,而純化提取物R和PA的增殖率又明顯大于醇提物E,說(shuō)明桑白皮醇提物經(jīng)進(jìn)一步純化后對(duì)MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的促增殖作用有所增強(qiáng)。結(jié)合“2.2”項(xiàng)下各提取物的黃酮含量測(cè)定結(jié)果(PA>R>E>W),表明桑白皮不同提取物對(duì)成骨細(xì)胞的促增殖作用與其黃酮含量有關(guān),活性作用隨黃酮含量增加而增強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是骨重構(gòu)過(guò)程中的重要組成部分,二者處于生理平衡狀態(tài),這種平衡一旦被打破就會(huì)引起骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病[19]。以破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞作為體外活性篩選模型,是開(kāi)發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物和保健食品的重要途徑。

黃酮類物質(zhì)作為功能性食品的重要活性成分,廣泛存在于藥用和食用植物中[20]。并且,許多黃酮類物質(zhì)顯示出了較好的骨保護(hù)性能和抗骨質(zhì)疏松特性[21-22]。研究表明,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、氧化應(yīng)激、雌激素缺乏都能引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生[23-25],而天然黃酮類物質(zhì)具有抗炎、抗氧化和植物雌激素樣作用[26-27],因此黃酮類物質(zhì)的抗骨質(zhì)疏松特性與其自身的生物活性密切相關(guān)。

本文利用1α,25-(OH)2VitD3誘導(dǎo)兔骨髓細(xì)胞建立的破骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蚆C3T3-E1 Subclone 14成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究桑白皮不同提取物的體外活性作用。研究表明,桑白皮提取物在一定劑量下能夠抑制破骨細(xì)胞的形成,且對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用,表明桑白皮具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞平衡協(xié)作的潛力。桑白皮中黃酮類化合物含量豐富[28],本文制備了桑白皮的不同提取物并對(duì)其黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),桑白皮提取物對(duì)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活性作用與黃酮含量有關(guān),隨黃酮含量增加而增強(qiáng),推測(cè)黃酮類化合物可能是桑白皮發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松活性作用的重要成分,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)。