姜雅杰,王 暢,席茂盛,羅學(xué)剛,2,*,陳列歡

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心,天津 300457;3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,廣東廣州 510225;4.廣州優(yōu)藍(lán)海洋生物科技有限公司,廣東廣州 510530)

現(xiàn)今,由飲食過(guò)剩引起的慢性代謝性疾病如肥胖和糖尿病的發(fā)病率已逐漸成為全世界日益引人注目的社會(huì)健康問(wèn)題;據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(IDF)統(tǒng)計(jì),2017年全世界的糖尿病患者人數(shù)約為4.25億人,而中國(guó)糖尿病患者人數(shù)已達(dá)1.14億,占全球糖尿病患者總數(shù)的1/3,而Ⅱ型糖尿病(T2DM)占糖尿病患者總數(shù)的90%以上[1-2]。因此,對(duì)T2DM預(yù)防和有效治療方法的研究具有重要意義和緊迫性。然而,目前的降糖藥物都具有不同程度的毒副作用,因此天然無(wú)毒副作用的降血糖產(chǎn)品成為研究熱點(diǎn)。

腸道菌群是人體內(nèi)最大的微生態(tài)系統(tǒng),一般情況下,人體腸道微生物群落的占比和結(jié)構(gòu)多樣性都是處于相對(duì)平衡的狀態(tài),然而,這種平衡在一定條件下會(huì)被打破導(dǎo)致宿主疾病[3]。影響腸道微生物菌群的穩(wěn)態(tài)和多樣性的因素有很多,比如使用抗生素、飲食習(xí)慣、環(huán)境等均會(huì)對(duì)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)與多樣性產(chǎn)生一定的影響[4]。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)腸道微生態(tài)的認(rèn)識(shí)更加的全面,腸道微生態(tài)與疾病之間的相互作用也成為研究的熱點(diǎn)。T2DM是一種以代謝紊亂為特征的慢性疾病,其發(fā)病原因較為復(fù)雜,目前認(rèn)為其發(fā)病主要原因是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的[5]。不過(guò),也有研究證明,腸道菌群失調(diào)也是引起糖尿病的一個(gè)重要原因[6]。

殼寡糖(COS)是存在于自然界中的堿性寡糖,它作為一種重要的海洋性功能寡糖,具有降膽固醇[7]、調(diào)節(jié)免疫[8]等多種特性,同時(shí)對(duì)腸道菌群有重要的調(diào)節(jié)作用;β-葡聚糖和水蘇糖都是功能性的糖類,具有促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌的增殖繼而提高其所占比例、抑制腸道內(nèi)有害菌的生長(zhǎng)、阻止外源性病原菌在腸道的定植、增加機(jī)體腸道免疫力等生理功能[9-10]。白蕓豆提取物含有α-AI(天然的α-淀粉酶抑制劑),它可以通過(guò)降低淀粉類的消化率來(lái)輔助降低Ⅱ型糖尿病病人血糖[11]。亞麻籽油富含α-亞麻酸,α-亞麻酸能有效降低高血脂和高血液粘稠度,改善微循環(huán),有助于糖尿病人的康復(fù)。目前市面以殼寡糖為原料并且上市的殼寡糖產(chǎn)品并不多,而以殼寡糖為主要原料并配比白蕓豆、水蘇糖、β-葡聚糖,亞麻籽油的功能性復(fù)合固體飲料還尚未見(jiàn)到。

因此,本文參考中醫(yī)藥講究的“君臣佐使”理念,以殼寡糖為“君”,白蕓豆提取物為“臣”,水蘇糖和葡聚糖為“佐”,亞麻籽油為“使”,將其合理科學(xué)配伍研發(fā)了殼寡糖復(fù)合固體飲料“殼糖平”;并利用T2DM小鼠模型,運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)就其對(duì)糖尿病小鼠腸道菌群的影響,展開(kāi)較為系統(tǒng)的分析,為其合理應(yīng)用及保健食品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼糖平及殼寡糖 廣州優(yōu)藍(lán)海洋生物科技有限公司;昆明小鼠 健康雄性清潔級(jí),4周齡(體重18～22 g),生產(chǎn)許可證:SCXK(軍)2007-004,合格證號(hào):00549571;高脂飼料和基礎(chǔ)飼料 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;阿卡波糖片(Acar) 杭州中美華東制藥有限公司;AxyPrep DNA提取試劑盒 AXYGEN公司;KOD Polymerase Illumina公司。

702超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Forma公司;YDS-50B-20液氮罐 四川亞西機(jī)器有限公司;Quanti FluorTM熒光計(jì) Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立 健康雄性SPF昆明小鼠70只(4周齡,20±2 g),按照體重隨機(jī)分組分為7組,正常對(duì)照組(NFD)、模型組(T2DM)、陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖組(Acar)、殼寡糖組(COS)、殼糖平低劑量組(LKTP)、殼糖平中劑量組(MKTP)、殼糖平高劑量組(HKTP)。實(shí)驗(yàn)小鼠以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,T2DM、Acar、COS、LKTP、MKTP和HKTP組小鼠禁食不禁水12 h,采用65 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)連續(xù)3 d進(jìn)行腹腔注射,造模期間飼喂高脂飼料。注射藥物5 d后,小鼠尾靜脈取血,測(cè)定小鼠的血糖,空腹血糖水平≥7.0 mmol/L,餐后2 h血糖水平≥11.1 mmol/L為造模成功[12-13]。小鼠從第3周后開(kāi)始連續(xù)灌胃4周實(shí)驗(yàn)樣品;灌胃定于每天上午9:30開(kāi)始,其中NFD組、T2DM組小鼠每天PBS(10 mmol/L,pH=7.4)的灌胃量為0.2 mL/只/天,根據(jù)小鼠的體重計(jì)算Acar組50 mg/kg、COS組80 mg/kg、LKTP組40 mg/kg、MKTP組80 mg/kg、HKTP組120 mg/kg灌胃量,灌胃期間小鼠自由飲食。

1.2.2 小鼠的處理與組織保存 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠禁食12 h,采用斷頸法處死小鼠,進(jìn)行解剖摘取小鼠橫結(jié)腸部分裝于離心管中,迅速置于液氮罐中冷卻,保存于超低溫冰箱(-80 ℃)中備用。

1.2.3 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物菌群DNA提取16S和測(cè)序 將保存在超低溫冰箱中的結(jié)腸內(nèi)容物取出解凍。利用DNA提取試劑盒提取盲腸內(nèi)容物微生物總DNA。用帶有Barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)。引物序列為:341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT[14]。PCR反應(yīng)體系50 μL:10×KOD緩沖液5 μL、5 μL(2.5 mmol/L)DNTPS、正反引物(5 μmol/L)各1.5 μL、1 μL KOD聚合酶和100 ng模板DNA,補(bǔ)充ddH2O至50 μL;PCR所需要的反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;退火溫度62 ℃ 30 s;68 ℃ 30 s,27個(gè)循環(huán);68 ℃延伸10 min。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,運(yùn)用切膠回收試劑盒回收目的片段,并進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測(cè)序接頭,構(gòu)建測(cè)序文庫(kù),運(yùn)用Hiseq2500 PE250上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)的處理 采用高通量Illumina Hiseq 2500測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)。將測(cè)序得到的原始下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw data)進(jìn)行預(yù)處理。具體的處理步驟如下:a.使用FASTP(https://github.com/opengene/fastp)將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾;b.使用FLASH軟件包將過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行Tags拼接;c.利用QIIME軟件將拼接后的Tags過(guò)濾,得到高質(zhì)量干凈的Tags;d.將過(guò)濾后的Tags在數(shù)據(jù)庫(kù)(http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)中進(jìn)行比對(duì)搜索,并使用Uchime算法將比對(duì)后高質(zhì)量Tags去嵌合體,獲得Effective tags用于進(jìn)一步分析。最后利用Mothur軟件包對(duì)Tag序列進(jìn)行了去冗余處理,從中挑選出Unique tag序列。

1.3.2 OUT聚類 OTU(Operational Taxonomic Units)是指為了方便在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究,人為設(shè)定的分類單元。利用Effective tags之間的序列相似性關(guān)系,可以將不同的Tags聚類成OTU。為了研究樣品的物種的組成多樣性信息,用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部Effective tags序列聚類,默認(rèn)提供以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units)結(jié)果,并計(jì)算出每個(gè)OTU在各個(gè)樣品中的Tags絕對(duì)豐度和相對(duì)信息。根據(jù)OTU豐度和序列信息,利用SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arb-silva.de/)或Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)的RDP軟件包分類器,通過(guò)一種簡(jiǎn)單的貝葉斯模型將代表序列進(jìn)行微生物分類。用Krona軟件包可視化每個(gè)分類的豐度統(tǒng)計(jì)。用Metastats軟件和LEFSe軟件進(jìn)行各組的標(biāo)志生物篩選。最后利用相關(guān)軟件,對(duì)每組樣品逐一開(kāi)展物種注釋、群落多樣性、組間差異等多種核心分析。統(tǒng)計(jì)分析采SPSS 17.0軟件進(jìn)行,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU及多樣性分析

由表1可知每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的有效序列為130301～244496條,其長(zhǎng)度范圍在315～478 bp。本研究中各實(shí)驗(yàn)組OTU范圍為1367～1835,腸道菌群的物種覆蓋率大于0.99,表明本研究測(cè)序覆蓋率和深度可滿足樣品16S測(cè)序分析需求[15]。由圖1A可知,7組小鼠結(jié)腸樣品的稀釋曲線在100000趨向于平坦,說(shuō)明本研究樣品測(cè)序數(shù)據(jù)可靠測(cè)序深度滿足要求;如圖1B Shannon-Wiener曲線趨向平坦,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)物種豐富度高且分布均勻,其中NFD組樣品群落多樣性最高,其它依次是COS組、MKTP組、T2DM組、LKTP組、HKTP組、Acar組。表1可知,NFD組ACE指數(shù)(2720.99)、Chao1指數(shù)(2745.55)、Shannon香農(nóng)指數(shù)(7.31)值都是最高的,說(shuō)明高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠腸道菌群發(fā)生了顯著變化,使得其腸道菌群的多樣性降低,而灌服COS、LKTP和MKTP提高了Shannon香農(nóng)指數(shù),說(shuō)明灌服殼寡糖及殼糖平可有效恢復(fù)T2DM小鼠腸道菌群多樣性。

表1 各組樣品有OTUs數(shù)量和菌群多樣性

圖1 稀釋曲線(A)和Shannon-Wiener曲線(B)分析

2.2 不同分組之間OTU物種差異和PCA分析

如圖2所示,根據(jù)OTU豐度信息開(kāi)展韋恩圖分析,7組樣本含有的特有的OTU個(gè)數(shù)分別為326(NFD組)、223(T2DM組)、237(Acar組)、118(COS組)、197(LKTP組)、142(MKTP組)、181(HKTP組)。其中有556個(gè)OTU是7組共有?；贠UT數(shù)據(jù),組間PCoA圖表明,小鼠腸道樣品情況,其反映在PCoA圖中的距離遠(yuǎn)近上,如圖3所示,NFD、T2DM、Acar、COS、LKTP、MKTP和HKTP組內(nèi)樣品距離相近,說(shuō)明所有實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)樣品具有良好的平行性和重復(fù)性;T2DM組與COS組距離較近,而Acar、LKTP、MKTP和HKTP組與T2DM組距離較遠(yuǎn),說(shuō)明與T2DM組相比,COS組的處理效應(yīng)弱,Acar、LKTP、MKTP和HKTP組處理效應(yīng)強(qiáng)。

圖2 7組樣本OTU水平上的維恩圖

圖3 小鼠腸道樣本PCoA分析

2.3 在門(mén)水平上的菌群豐度及差異

基于OUT數(shù)據(jù),將微生物由門(mén)到種進(jìn)行各個(gè)水平上的分類,如圖4所示,各組小鼠在門(mén)(phylum)的水平上的菌群組成主要由厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變行菌門(mén)(Proteobaterria)、酸桿菌門(mén)(Actinobateria)、藍(lán)菌門(mén)(Cyanobacteria)、Saccharibacteria、疣微菌(Verrucomicrobia)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)等10個(gè)菌門(mén)組成,其中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為主要優(yōu)勢(shì)菌,這與Larsen等[16]研究報(bào)道一致。與NFD組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)相比(38.33%),在T2DM組顯著升高(54.57%,P<0.05);而Acar組、COS組、LKTP組、MKTP組、HKTP組與T2DM模型組相比均可顯著降低厚壁菌門(mén)豐度(P<0.05),其中Acar組占比28.61%、COS組占比30.40%、LKTP組占比20.00%、MKTP組占比20.76%、HKTP組占比23.89%。與NFD組相比(占比為56.31%),擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)豐度在T2DM組(P<0.05),其中MKTP組占比最高(75.88%)、其次是LKTP組占比74.27%、HKTP組占比67.64%、COS組占比65.90%、Acar組占比64.48%。研究表明,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)協(xié)同作用于宿主能量吸收或代謝[17-18];而糖尿病患者腸道與正常人腸道對(duì)比擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)顯著性降低,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)顯著性升高[19-20]。

圖4 7組樣本在門(mén)水平上的相對(duì)豐度

由此可知,高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病模型組小鼠厚壁菌門(mén)(Firmicutes)升高,擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)降低,而灌服殼糖平對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠腸道菌群失調(diào)具有一定改善調(diào)節(jié)作用,其中殼糖平中劑量組作用效果最顯著。

2.4 在科水平上的菌群組成及差異分析

如圖5所示,7組樣本在科分類水平上的主要組成菌為:擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、毛螺科菌(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、普雷沃氏菌(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)等10個(gè)菌科;其中擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、毛螺科菌(Lachnospiraceae)為兩種豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌,占比超過(guò)了57%。與正常對(duì)照組(NFD)相比,T2DM模型組擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)和普雷沃氏菌(Prevotellaceae)顯著下降(P<0.05),而毛螺科菌(Lachnospiraceae)和脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)顯著升高(P<0.05)。與模型組(T2DM)相比,Acar組、COS組、LKTP組、MKTP組、HKTP組擬桿菌目(Bacteroidales_S24-7_group)、普雷沃氏菌(Prevotellaceae)顯著升高(P<0.05),而毛螺科菌(Lachnospiraceae)和脫疏弧菌科(Desulfovibrionaceae)顯著降低(P<0.05),其中HKTP組Bacteroidales_S24-7_group升高最明顯,而Lachnospiraceae降低最明顯。如圖6,與陽(yáng)性藥組(Acar)相比,通過(guò)LEFse分析組間菌群差異,殼糖平中高劑量組擬桿菌群占主導(dǎo),且所占比例較高;相關(guān)研究表明,毛螺科菌(Lachnospiraceae)與腸道炎癥程度正相關(guān)[21];人類Ⅱ型糖尿病和T2DM模型小鼠的發(fā)病可能與Lachnospiraceae相關(guān)[22-23]。Desulfovibrionaceae是一種硫酸鹽還原菌,能夠產(chǎn)生毒素并破壞粘膜屏障與炎癥密切相關(guān)[24];Prevotellaceae是一種與腸道通透性相關(guān)的黏蛋白降解菌[25],在抵御病原菌方面發(fā)揮重要作用;腸道中的Bacteroidales_S24-7_group是丁酸鹽產(chǎn)生菌,丁酸鹽是腸道上皮的能量提供源,并有助于腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,從而提高機(jī)體的腸道免疫力[26-31]。

圖5 七組樣本在科水平上的相對(duì)豐度

圖6 各實(shí)驗(yàn)組的LEFse分析比較

本研究結(jié)果表明,灌服殼糖平可以改善T2DM小鼠腸道炎癥程度,促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)而抑制致病菌的增殖,從而使得腸道免疫力增強(qiáng),同時(shí)使得宿主整體內(nèi)環(huán)境協(xié)調(diào)穩(wěn)定。

3 結(jié)論

腸道微生物可以反向調(diào)節(jié)宿主健康狀況,本研究結(jié)果表明,與模型組(T2DM)相比,灌服殼糖平可顯著增加T2DM小鼠腸道Bacteroidales_、S24-7_group、Prevotellaceae的相對(duì)豐度,這些菌可能與改善Ⅱ型糖尿病小鼠癥狀有關(guān);并且,灌服殼糖平使得T2DM小鼠腸道Firmicutes、Lachnospiraceae和Desulfovibrionaceae的相對(duì)豐度減少,這些菌可能與Ⅱ型糖尿病發(fā)生有關(guān);這些發(fā)現(xiàn)表明適當(dāng)劑量殼糖平具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高腸道免疫力同時(shí)輔助治療Ⅱ型糖尿病的功效。