齊 賀,毛俊龍,姚 慧,祁雪兒,武天昕,張 賓

(浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江舟山 316022)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)蝦殼薄、肉質(zhì)鮮嫩,其蛋白質(zhì)、氨基酸及維生素等含量高,深受國內(nèi)外市場的歡迎。冷凍貯藏是蝦類產(chǎn)品長期保存的最主要方式,其可抑制微生物生長、降低生物酶活性,還可保持蝦類風味和營養(yǎng)價值[1-2]。但隨著凍藏時間延長,即使在微小溫度波動甚至恒定溫度條件下,肌肉中冰晶仍會有一定的凍融現(xiàn)象,致使冰晶發(fā)生重結(jié)晶及不斷生長,其原因是冰晶表面的水分子由于表面自由能較高而不能被牢固地束縛,這些水分子會從小冰晶表面擴散并沉積到大冰晶表面上,導致較大冰晶不斷形成,最終造成肌肉持水不斷力下降,肌肉纖維完整性和細胞膜損傷加劇[3]。

添加磷酸鹽化合物到冷凍蝦類產(chǎn)品中可起到增加肌肉保水性,保持組織質(zhì)構(gòu)特性以及降低解凍和烹飪汁液損失的作用[4-5]。但磷酸鹽在蝦類產(chǎn)品中過量添加會使蝦類制品產(chǎn)生不愉快的金屬澀味,還會造成肌肉組織粗糙及出現(xiàn)由磷酸鹽的沉淀作用而引發(fā)的“雪花”和“晶化”現(xiàn)象[6]。目前,許多國家對蝦類產(chǎn)品中磷酸鹽的使用含量有嚴格的限定,具有良好保水能力的替代型添加劑研發(fā),逐漸成為冷凍水產(chǎn)品領域中的研究熱點。

糖類物質(zhì)應用于冷凍水產(chǎn)品中,可改變包埋在蛋白質(zhì)分子中結(jié)合水的狀態(tài),取代蛋白質(zhì)分子表面的結(jié)合水并與之結(jié)合,可達到抑制肌肉蛋白質(zhì)冷凍變性的效果[7]。目前,常以山梨醇和蔗糖混合物作為水產(chǎn)品抗凍劑,但蔗糖的甜味和熱量相對較高;此外,常見糖類如海藻糖、乳糖醇[8-9],水凝膠劑類碳水化合物如幾丁質(zhì)、殼聚糖[10]和魔芋葡甘聚糖等[11]已被證實為有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和冰晶生長抑制劑。目前,關(guān)于糖類物質(zhì)在凍藏蝦仁中的研究有較多報道,但關(guān)于在凍藏溫度波動條件下(凍融影響)多羥基糖類物質(zhì)對蝦仁品質(zhì)特性的影響研究,還鮮見報道。

因此,本研究以冷凍南美白對蝦蝦仁為對象,以低聚木糖、卡拉膠寡糖、海藻糖和海藻膠寡糖為抗凍保護劑,在凍藏溫度波動條件下,比較分析不同糖類對冷凍蝦仁品質(zhì)的影響,以期減少冷凍蝦類制品的汁液損失、保障產(chǎn)品品質(zhì),為開發(fā)及應用糖類抗凍保水劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活南美白對蝦(體長6～12 cm,31～44 g) 購于浙江舟山臨城老碶菜場,30 min內(nèi)冰溫運至實驗室;低聚木糖(DP 2～5)、卡拉膠寡糖(DP 2～5)、海藻膠寡糖(DP 2～5)、焦磷酸鈉、海藻糖 青島博智匯力生物科技有限公司;肌原纖維蛋白含量試劑盒、Ca2+-ATPase活性試劑盒、總巰基含量試劑盒 購于南京建成生物工程研究所;所用其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

MDF-U53V型超低溫冰箱 日本Sanyo公司;CR-10型便攜式色差儀 日本柯尼卡美能達公司;TMS-Pro物性測試儀 美國FTC公司;751UVGD型紫外-可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;CF-16RN型高速冷凍多用途離心機 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦仁制備 南美白對蝦于0～4 ℃條件下清洗,經(jīng)去頭、去殼、去尾、去蝦線等操作,選取大小均一且完整的蝦仁,瀝干并用紗布拭干水分,備用。

1.2.2 蝦仁預處理 浸泡處理:稱取蝦仁6份,每份約200 g,將每份蝦仁分別浸于3%(w/V)的低聚木糖、卡拉膠寡糖、海藻糖、海藻膠寡糖和焦磷酸鈉(陽性對照),同時以蒸餾水作陰性對照,4 ℃浸泡4 h,每隔20～30 min輕攪拌1次;取出用紗布拭去表面水分。

冷凍-解凍處理:將蝦仁包裝后,置于-55 ℃超低溫冰箱中冷凍6 h。隨后,將冷凍蝦仁轉(zhuǎn)移至-18 ℃冰箱中凍藏24 h,取出于4 ℃冰箱中解凍3 h(第1次凍融循環(huán));解凍蝦仁再次放入-18 ℃冰箱中凍藏24 h,取出于4 ℃冰箱中解凍3 h(第2次凍融循環(huán))。重復以上操作6次,取0、2、4和6次冷凍-解凍循環(huán)樣品進行指標測定。

1.2.3 解凍損失率測定 將解凍前蝦仁進行稱重(M1,精確到0.001 g),取出凍藏蝦仁于4 ℃冰箱中解凍3 h后,用紗布拭去表面水分后進行稱重(M2,精確到0.001 g),計算蝦仁解凍損失率。

蝦仁解凍損失率(%)=(M1-M2)/M1×100

1.2.4 色差值測定 采用便攜式色差儀測定蝦仁表面白度,均以蝦仁背部第二節(jié)為測試點,記錄明度值(L*值)。L*=0,表示肉色為黑色,L*=100,表示為白色。儀器采用標準白板進行校正。

1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性測定 將蝦仁樣品置于測定平臺,使用P/50圓柱形有機玻璃探針,模擬二次咀嚼過程。TPA測定參數(shù):恒速1.0 mm/s,樣品壓縮形變30%,兩個循環(huán)之間保持3 s。使用FTC-PRO軟件從樣品產(chǎn)生的力-時間曲線中,計算質(zhì)構(gòu)特性參數(shù)。

1.2.6 肌原纖維蛋白含量測定 依據(jù)Zhang等[12]報道方法,準確稱取組織重量,按1∶9 g/mL加入9倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下機械勻漿(2500 r/min,10 min),取上清液(肌原纖維蛋白),并采用試劑盒法測定肌原纖維蛋白含量。

1.2.7 肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性測定 參照1.2.6肌原纖維蛋白提取法提取,參照試劑盒的方法依次加入樣本和試劑,然后室溫靜止5 min,于波長636 nm處用雙蒸水調(diào)零,測定各管的吸光度值,計算Ca2+-ATPase 活性。

Ca2+-ATPase活性(U/mg)=(OD測定-OD對照)/(OD標準-OD空白)×標準品濃度×6×2.8/待測樣本蛋白濃度。

1.2.8 肌原纖維蛋白總巰基含量測定 參照1.2.6提取肌原纖維蛋白,參照試劑盒的方法依次加入樣本和試劑,然后室溫靜止10 min,于波長412 nm處用雙蒸水調(diào)零,測定各管的吸光度值,計算總-SH含量。

CO(mg/g)=A/ξ

式中:A:412 nm處吸光值;ξ:分子吸光系數(shù)13600(mol·cm/L)。

1.2.9 蝦仁微觀結(jié)構(gòu)測定 以新鮮蝦仁和反復凍融6次后蝦仁為實驗對象,固定蝦仁背部第2節(jié)肌肉,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后觀察其肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.1、SPSS 13.0軟件進行作圖及數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表示為“M±SD”,采用SNK法分析測驗顯著性水平,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同糖類處理對凍藏蝦仁解凍損失率的影響

凍藏溫度波動條件下,冷凍蝦仁肌肉組織中冰晶不斷凍融而逐漸生長(重結(jié)晶),致使對肌肉細胞組織的物理損傷加劇,造成解凍后肌肉中各種氨基酸、礦物元素及維生素等物質(zhì)流失[3]。在凍藏溫度波動條件下,不同糖類物質(zhì)對蝦仁肌肉解凍損失率的影響如圖1所示,各處理組蝦仁的解凍損失率均隨凍融次數(shù)增加而顯著增大(P<0.05,焦磷酸鈉處理除外)。經(jīng)反復凍融6次后,蒸餾水組蝦仁解凍損失率由初始的5.73%升高至8.38%;幾種糖類處理蝦仁解凍損失率均明顯低于蒸餾水組,其中效果最好的是卡拉膠寡糖組,其解凍損失率變化范圍為4.98%～5.65%,保水效果優(yōu)于焦磷酸鈉組;其次,海藻膠寡糖組解凍損失率變化范圍為5.18%～6.30%,與焦磷酸鈉組效果接近。此外,低聚木糖和海藻糖對凍藏蝦仁,也表現(xiàn)出一定的水分保持作用,但其保水效果仍低于焦磷酸鈉組(P<0.05)。因此,糖類處理對凍藏蝦仁表現(xiàn)出較好保水能力,可減少溫度波動條件下蝦仁解凍汁液流失,其原因一方面可能是凍藏過程中抑制了冰晶的重結(jié)晶及生長作用,減弱了冰晶對肌肉組織的機械損傷作用,使得肌肉內(nèi)部水分得以有效保持[14];另一方面,卡拉膠寡糖、海藻膠寡糖等糖類分子上,具有較多的活性羥基基團,可與肌肉中Ca2+、Mg2+等金屬離子發(fā)生螯合作用,進而通過離子強度調(diào)節(jié)作用而阻止肌肉組織內(nèi)部水分的大量流失[15]。

圖1 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁解凍損失率的影響

2.2 不同糖類處理對凍藏蝦仁L*值的影響

色澤是評價冷凍蝦仁感官品質(zhì)的重要指標。前期實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)反復凍融后蝦仁肌肉組織發(fā)白,色差(a*和b*)較為相似,不易區(qū)分色澤變化,故以凍藏蝦仁明度值(L*)作為評價指標。由圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同方式處理后蝦仁肌肉L*值,均隨凍融次數(shù)增加而顯著增大(P<0.05,卡拉膠寡糖處理除外),主要是由于冷藏過程中形成的冰晶及重結(jié)晶擠壓破壞肌肉細胞及組織結(jié)構(gòu),促使細胞內(nèi)部水分溶出導致蝦肉表面游離水增多,增強了對光的反射效果所致[16]。在凍融6次后,蒸餾水組蝦仁肌肉表面L*值升高了11.8%,顯著高于其它處理組(P<0.05);不同糖類處理蝦仁L*值升高程度,從小到大依次為低聚木糖(4.21%)、卡拉膠寡糖(5.60%)、焦磷酸鈉(6.58%)、海藻膠寡糖(6.75%)和海藻糖(10.77%),其中低聚木糖、卡拉膠寡糖組效果均優(yōu)于焦磷酸鈉組。由此可見,低聚木糖、卡拉膠寡糖浸泡處理,在一定程度上可減少凍融過程中冰晶對細胞膜的機械損傷作用。

圖2 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁L*值的影響

2.3 不同糖類處理對凍藏蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響

冷凍蝦仁肌肉組織硬度、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性會隨肌肉蛋白質(zhì)變性程度而發(fā)生變化,咀嚼性作為肌肉硬度、彈性及黏聚性的綜合體現(xiàn),在一定范圍內(nèi)其值越大表征肉質(zhì)口感越好。圖3結(jié)果表明,經(jīng)反復凍融6次后,相比于蒸餾水組,不同糖處理對蝦仁肌肉硬度、咀嚼性特性保持作用顯著(P<0.05);其中,海藻糖、海藻膠寡糖、卡拉膠寡糖及低聚木糖組蝦仁,肌肉硬度值依次為1.22、1.23、1.26和1.09 mm,均顯著高于蒸餾水組(0.79 mm)。第6次凍融后,海藻糖、海藻膠寡糖、卡拉膠寡糖及低聚木糖組蝦仁,肌肉咀嚼性值依次為4.21、5.76、5.35和4.53 mJ,也顯著優(yōu)于蒸餾水處理效果(2.83 mJ)。此外,隨著反復凍融次數(shù)的增加,幾種糖類處理蝦仁肌肉的膠黏性并無顯著性差異(P>0.05),但仍顯著優(yōu)于蒸餾水處理組(結(jié)果未呈現(xiàn))。本研究中,幾種糖處理對蝦仁肌肉質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性起到較好維持作用,可能歸因于糖類物質(zhì)玻璃化轉(zhuǎn)變狀態(tài)的部分特質(zhì),包括如糖類分子的低自由體積、限制水分子流動以及在冷凍貯存過程中抵抗重結(jié)晶生長的能力[17]。

圖3 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.4 不同糖類處理對凍藏蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響

肌肉蛋白質(zhì)功能特性主要由肌原纖維蛋白決定,凍藏過程中肌原纖維蛋白溶解度降低,對應的鹽溶性蛋白含量也相應下降,在一定范圍內(nèi),肌原纖維蛋白含量越高,肌肉蛋白質(zhì)功能性也相對較為穩(wěn)定。不同處理對凍藏蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響如圖4所示,各處理組蝦仁肌肉組織中肌原纖維蛋白含量隨凍融次數(shù)的增加而顯著下降(P<0.05);其中,蒸餾水組蝦仁肌原纖維含量呈現(xiàn)出較快的下降趨勢,下降了14.0%。海藻糖和海藻膠寡糖組下降趨勢相對較為平緩,分別下降了7.44%和7.13%,保護效果顯著優(yōu)于蒸餾水組(P<0.05),同時相較于焦磷酸鈉組(下降7.18%)效果接近。研究表明,肌肉中肌原纖維蛋白含量下降,可能是由于蛋白質(zhì)周圍部分結(jié)合水形成冰晶,促使肌動球蛋白分子間形成非共價鍵,進而形成超大分子的不溶解凝集體所致[18];另一方面,凍融期間肌原纖維和肌內(nèi)結(jié)締組織發(fā)生了降解作用,而導致肌原纖維蛋白含量不斷下降[19]。本實驗中,幾種糖處理有效抑制了反復凍融期間肌原纖維蛋白含量的快速降低,對維持蝦仁肌肉蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及功能性起到積極作用。

圖4 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響

2.5 不同糖類處理對凍藏蝦仁的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

蝦仁凍藏過程中形成的冰及體系中離子強度的增強,均會改變肌球蛋白的頭部結(jié)構(gòu),致使其Ca2+-ATPase活性下降[20]。在凍藏溫度波動條件下,不同糖處理對蝦仁肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響如圖5所示,在反復凍融過程中,各組蝦仁肌肉組織中Ca2+-ATPase活性均呈下降趨勢,且在凍融前期下降速率較高,之后趨于平緩。經(jīng)反復凍融6次后,蒸餾水組Ca2+-ATPase活性下降速度最快(0.111～0.078 U/mg);卡拉膠寡糖和海藻膠寡糖組Ca2+-ATPase活性變化幅度相對較小,分別為24.40%和18.31%,二者對蝦仁肌肉Ca2+-ATPase活性的保持作用明顯優(yōu)于蒸餾水組。其他兩種糖處理對凍藏蝦仁Ca2+-ATPase活性的保持作用,均高于蒸餾水組,但仍低于卡拉膠寡糖和海藻膠寡糖組。該部分研究結(jié)果與蝦仁解凍損失率測定結(jié)果相一致。也有研究認為,肌肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的喪失,與肌肉組織中產(chǎn)生冰晶的數(shù)量、大小及形狀等密切相關(guān),即冰晶顆粒的不斷生長及重結(jié)晶現(xiàn)象加劇,通過物理作用引起肌球蛋白頭部構(gòu)象變化,進而影響Ca2+-ATPase活性變化[21]。此外,由保水能力下降引起的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,也可能導致Ca2+-ATPase活性的降低[22]。

圖5 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

2.6 不同糖類處理對凍藏蝦仁肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

蝦仁凍藏過程中形成的冰晶,會促使肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使隱藏在分子內(nèi)部的巰基活性基團暴露出來,氧化易形成二硫鍵,因此巰基含量可作為蛋白質(zhì)變性程度的評價指標之一。如圖6所示,凍融過程中,各組蝦仁中肌原纖維蛋白總巰基含量均顯著降低(P<0.05),其中以蒸餾水組蝦仁總巰基含量下降程度最大,經(jīng)反復凍融6次后為6.13 mmol/L;而海藻糖和海藻膠寡糖處理組總巰基含量仍保持在7.22和7.98 mmol/L,顯著高于蒸餾水組(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),糖類分子中的游離羥基可與水分子通過共價鍵結(jié)合,減緩水分子凍結(jié)成冰的速率和程度,可有效抑制冰晶的不斷長大[23]。同時,這些活性基團還能與肌肉蛋白質(zhì)分子結(jié)合,使得蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,從而減少了凍藏過程中蝦仁巰基活性基團的暴露,阻礙其氧化為二硫鍵,最終減緩肌原纖維蛋白總巰基的降低速率[2]。

圖6 不同糖處理對溫度波動下凍藏蝦仁肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

2.7 不同糖類處理對凍藏蝦仁微觀結(jié)構(gòu)的影響

凍藏溫度波動條件下,冰晶生長對凍藏水產(chǎn)品品質(zhì)影響較大,其使肌肉肌纖維擠壓變形,甚至局部發(fā)生斷裂、肌肉細胞受到機械損傷,造成蛋白質(zhì)發(fā)生變性、解凍液汁流失增加[24]。不同糖處理對反復凍融蝦仁肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖7所示,新鮮蝦仁肌肉(圖7G)纖維彼此緊密連接,結(jié)締組織排列均一整齊,且空隙較少。反復凍融6次后,蒸餾水處理樣品肌肉(圖7F)中肌纖維發(fā)生嚴重紊亂,組織破壞嚴重,肌纖維產(chǎn)生許多小片段,細胞外間隙明顯增大,這主要是由于凍融過程中蝦仁肌肉中自由水、部分結(jié)合水從肌原纖維內(nèi)部移動到肌原纖維外部,甚至移動到肌束外部形成較大冰晶,因而嚴重破壞了組織結(jié)構(gòu)[25]。海藻糖、海藻膠寡糖、卡拉膠寡糖和低聚木糖(圖7A～圖7D)處理蝦仁,肌纖維排列仍較為緊致,細胞外間隙明顯小于蒸餾水組,同時較陽性對照組無嚴重的扭曲現(xiàn)象,可能主要是由于糖類通過滲透作用進入蝦仁組織間隙,與附近的水分子和蛋白質(zhì)濃縮,阻礙了肌肉間隙中冰晶的生長,減小了蝦仁肌肉組織在凍藏期間受到的損害[26]。同時,焦磷酸鈉組(圖7E)蝦仁肌肉間隙仍較小,說明起到了較好的組織結(jié)構(gòu)保護效果。

圖7 不同糖處理對反復凍融6次蝦仁肌肉(橫切)HE染色的結(jié)果

3 結(jié)論

在蝦仁的反復凍融過程中,海藻糖、海藻膠寡糖、卡拉膠寡糖和低聚木糖浸泡處理均表現(xiàn)出良好的保水能力,反復凍融6次后,卡拉膠寡糖組解凍損失率較蒸餾水組減少了2.73%,較陽性對照組減少了0.75%,有效減少了蝦仁解凍過程中汁液的流失。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的不斷增加,幾種糖類物質(zhì)可有效減緩凍藏蝦仁肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性的快速下降,且對蝦仁的色澤和質(zhì)構(gòu)具有一定保護作用,與焦磷酸鈉效果相近。同時,糖類處理能夠維持肌肉組織完整性和肌纖維束的致密排列,效果優(yōu)于陽性對照組。因此,幾種糖類物質(zhì)可有效降低冰晶的生長和重結(jié)晶對凍藏蝦仁品質(zhì)特性的影響,可保障長途運輸及長期凍藏過程中蝦類制品的優(yōu)良品質(zhì)。后續(xù)研究將進一步探討不同濃度糖類對南美白對蝦作用效果,使之能更好地應用于水產(chǎn)品中。