孫 艷,崔旭盛,劉 靜,田 賀,楊艷芳,李雅芬,鮑晶晶,李春林,王 輕,張彥青,*,解軍波

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134;2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,河北石家莊 050035;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 301617)

酸棗葉又名棘葉,是鼠李科棗屬植物酸棗(ZiziphusjujubaMill var.spinosa(Bunge)Hu ex H. F. Chow)的葉子[1],具斂瘡解毒之效[2]。酸棗葉中含有豐富的三萜烯酸[3-4]、酚酸[5]、黃酮類化合物[6]及核苷類[7]等成分,具有顯著的抗氧化、抗炎抑菌、抗病毒等多種活性[8-9]。另外,酸棗葉在寧心安神、提高睡眠質(zhì)量等方面具有其獨到功效,具有“東方睡葉”之美稱[10]。

近年來,酸棗葉除少量藥用和制茶外,主要用于其化學(xué)成分的檢測分析,而對有效成分的提取方法和生物活性的研究較少。研究表明,黃酮類成分是酸棗葉中主要的活性成分[11],具有廣泛的生物活性。目前,黃酮類物質(zhì)的提取方法多是浸提法和加熱回流法[12],但是浸提法提取時間太長,加熱回流法所需溫度太高,有效成分結(jié)構(gòu)容易遭到破壞。近些年來超聲輔助提取技術(shù)被廣泛用于提取中藥化學(xué)成分[13],展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。

本研究將超聲輔助提取技術(shù)和響應(yīng)面優(yōu)化方法相結(jié)合,建立二項式回歸模型,對影響酸棗葉黃酮提取率的主要因素及其交互作用進(jìn)行分析探討,優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù)。以VC為對照,采用多種體外抗氧化活性方法考察酸棗葉黃酮的抗氧化活性。以秀麗隱桿線蟲為模型,通過考察熱應(yīng)激抗性、氧化應(yīng)激抗性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等方面,深入研究酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲氧化損傷的保護(hù)作用,對于綜合開發(fā)利用酸棗資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗葉 河北邢臺;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%) 北京化學(xué)試劑公司;D-101型大孔吸附樹脂 天津市南開大學(xué)化工廠;野生型秀麗隱桿線蟲(N2)、大腸桿菌OP50 Caenorhabditis Genetics Center;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所;DPPH、ABTS Sigma-Aldrich;鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵 天津市福晨化學(xué)試劑廠;30%H2O2、DMSO、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、次氯酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉 天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠;蛋白陳、瓊脂、酵母粉、氯化鈣、硫酸鎂、膽固醇、5-氟尿嘧啶 北京博奧科技有限公司;實驗中使用的所有試劑 均為分析純。

SB25-12 DTD型數(shù)控超聲波清洗器(40 kHz) 寧波新芝生物科技有限公司;V-700型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司;SpectraMax-M5多功能讀板機(jī) Molecular Devices,USA;DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;HNY2102恒溫培養(yǎng)箱 天津市歐諾儀器儀表有限公司;體視顯微鏡 丹東市百特儀器有限公司;VD-650-U超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸棗葉黃酮的提取 酸棗葉干燥(50～60 ℃下干燥至恒重)、粉碎、過40目篩后,按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇,然后采用超聲輔助提取法在一定的超聲溫度、一定的超聲功率下超聲一定的時間,提取酸棗葉黃酮,并通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 單因素實驗 本研究選擇影響黃酮提取率的液料比、乙醇濃度、提取溫度、超聲功率和超聲時間[14]五個因素進(jìn)行單因素考察,考察因素與水平如表1所示。

表1 單因素考察因素及水平

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,篩選出液料比、乙醇濃度、超聲功率、超聲時間四個影響因素,以這四個因素為自變量,酸棗葉黃酮提取率(Y)為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗[15],優(yōu)化酸棗葉黃酮提取工藝,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證實驗。

1.2.4 酸棗葉黃酮提取率的測定 以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對照,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[16]測定黃酮含量。以蘆丁含量(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得線性回歸方程:y=18.88x-0.006(R2=0.9993),在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

所有樣品低速(4000 r/min)離心3 min后,精密吸取上清液0.50 mL于10 mL量瓶中,依法測定吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)方程計算提取液中黃酮的濃度,并計算提取率。

式中:C:提取液中黃酮的濃度,mg;N:稀釋倍數(shù);V:提取液體積,mL;W表示樣品重量,mg。

1.2.5 酸棗葉黃酮的分離純化 以最優(yōu)工藝制備的酸棗葉醇提物為原料,D101型大孔吸附樹脂分離純化[17],依次用純水、20%、50%、70%、95%乙醇溶液洗脫,收集50%乙醇洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,真空冷凍干燥,得到酸棗葉黃酮粉末。通過紫外檢測法檢測黃酮純度為69.04%,用于后續(xù)的抗氧化活性研究。

1.2.6 酸棗葉黃酮體外抗氧化活性實驗 采用鐵氰化鉀還原法[18]測定黃酮的總還原力;DPPH法[19]測定黃酮對DPPH自由基的清除能力;ABTS法[20]測定黃酮對ABTS自由基的清除率;水楊酸法[21]測定黃酮對羥自由基的清除率,并計算半數(shù)清除濃度(IC50),VC作為陽性對照。

1.2.7 秀麗隱桿線蟲培養(yǎng) 野生型秀麗隱桿線蟲在20 ℃條件下于NGM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),并在NGM培養(yǎng)基表面涂布大腸桿菌OP50作為線蟲的食物。采用次氯酸鈉法[22]進(jìn)行線蟲的同步化,同步化后的線蟲培養(yǎng)至L4期,轉(zhuǎn)移到含有50、100和200 μg/mL的酸棗葉黃酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,1‰ DMSO作為對照。

1.2.8 秀麗隱桿線蟲急性氧化應(yīng)激實驗

1.2.8.1 熱應(yīng)激實驗 將同步化至L4期的線蟲分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,1‰ DMSO作為對照。之后用M9緩沖液洗滌3次,轉(zhuǎn)移到含有1‰ 5-氟尿嘧啶的NGM培養(yǎng)基中,35 ℃恒溫培養(yǎng)[23-24],每2 h記錄線蟲存活數(shù)量,直至線蟲全部死亡。

1.2.8.2 H2O2氧化應(yīng)激實驗 將同步化至L4期的線蟲分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,1‰ DMSO作為對照。之后用M9緩沖液洗滌3次,轉(zhuǎn)移到含有1‰ 5-氟尿嘧啶和3% H2O2的NGM培養(yǎng)基中[25],20 ℃恒溫培養(yǎng),每小時記錄線蟲存活數(shù)量,直至線蟲全部死亡。

1.2.9 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和丙二醛含量測定 將同步化至L4期的線蟲設(shè)置兩組,均分別在含有50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,1‰ DMSO作為對照。其中一組轉(zhuǎn)移到35 ℃培養(yǎng)6 h誘導(dǎo)線蟲氧化損傷,一組20 ℃培養(yǎng)6 h,生理鹽水洗滌3次后,加入200 μL生理鹽水冰上勻漿,離心,取上清液[26],根據(jù)試劑盒的操作方法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)三次,結(jié)果以M±S表示。使用Design-Expert(v8.0)軟件進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計和數(shù)據(jù)處理。Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,SPSS 16.0進(jìn)行單向方差分析(ANOVA),其中P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示極顯著,P<0.001表示高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

各因素對酸棗葉黃酮提取率的影響如圖1所示。圖1a中隨著液料比的升高,黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢,當(dāng)液料比為30∶1 mL/g時,提取率達(dá)到最大值3.39%,這可能是由于料液比在30∶1 mL/g時絕大部分的有效成分已經(jīng)溶出,繼續(xù)增大料液比并不能提高有效成分的溶出率[27]。圖1b可以看出,酸棗葉黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而逐漸升高,當(dāng)乙醇濃度為50%時,黃酮提取率最大，為3.31%,之后隨著乙醇濃度的升高,黃酮提取率逐漸降低,這可能與黃酮的極性相關(guān),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化,溶劑的極性發(fā)生變化,黃酮的提取率隨之改變[28]。圖1d可以看出,隨著超聲功率的增大,酸棗葉細(xì)胞壁的破碎程度增大,有效成分更易溶出,所以酸棗葉黃酮的提取率逐漸增大,在300 W時提取率為3.67%,之后超聲功率過大破壞了黃酮的分子結(jié)構(gòu)從而使提取率降低[29]。圖1e可以看出,酸棗葉中的黃酮類成分隨著時間的延長溶出率逐漸增大,黃酮的提取率逐漸增大,在40 min時提取率出現(xiàn)最大值3.68%,之后提取率降低可能是因為長時間的超聲振動導(dǎo)致黃酮的結(jié)構(gòu)遭到破壞,黃酮溶出率降低[30]。由圖1c可以看出,超聲溫度在20～60 ℃范圍內(nèi)對酸棗葉黃酮提取率無顯著影響。所以選擇液料比(25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)、乙醇濃度(70%、80%、90%)、超聲功率(250、300、350 W)和超聲時間(30、40、50 min)這四個因素設(shè)計響應(yīng)面實驗。

圖1 單因素水平對酸棗葉黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析 根據(jù)表2中的因素與水平值,建立四因素三水平響應(yīng)面實驗優(yōu)化提取工藝。響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面考察因素與水平

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 方差分析和二次多項回歸方程擬合 由Box-Benhnken實驗擬合出的回歸方程為:

Y=4.38+0.12A-0.12B+3.333E-003C-0.28D+0.18AB-0.098AC+0.073AD+0.12BC+0.087BD-0.055CD-0.30A2-0.63B2-0.57C2-0.18D2

二項式回歸模型系數(shù)的顯著性分析結(jié)果見表4。A(液料比)對酸棗葉黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01),B(乙醇濃度)對酸棗葉黃酮提取率有顯著影響(P<0.05),D(超聲時間)對酸棗葉黃酮提取率有高度顯著影響(P<0.001),C(超聲功率)對酸棗葉黃酮提取率無顯著影響(P>0.05),二次項A2、B2、C2和D2達(dá)到高度顯著水平(P<0.001)。各因素的影響重要性依次為:超聲時間(D)>液料比(A)>乙醇濃度(B)>超聲功率(C)。

表4 回歸模型的方差分析結(jié)果

2.2.3 因素間的交互效應(yīng)分析 通過Design-expert.V8.0.6軟件設(shè)計三維響應(yīng)面來反映最佳區(qū)域,固定兩個影響因素為中值,代入模型方程考察其余兩個因素間的相互作用[31-32],結(jié)果見圖2。

圖2 兩兩因素交互作用對酸棗葉黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖2可以看出,隨著各因素的水平在一定范圍的增大,酸棗葉黃酮提取率先升高后降低。液料比和乙醇濃度之間的交互作用,乙醇濃度和超聲功率之間的交互作用均對響應(yīng)值有顯著影響,其余兩兩因素間交互作用對響應(yīng)值沒有顯著的影響。

2.2.4 最佳提取率驗證 從三維響應(yīng)面圖中選取Y較理想的區(qū)域,求其代碼對應(yīng)的實際值,結(jié)合實際得出最佳提取工藝,由響應(yīng)面軟件分析得到酸棗葉黃酮最高提取率為4.51%。最佳提取工藝條件為液料比30.25∶1 mL/g、乙醇濃度79.00%、超聲功率301.00 W、超聲時間32.00 min。

在最佳提取工藝條件下提取酸棗葉黃酮,平行實驗三組,測得黃酮提取率為4.21%,與預(yù)測值4.51%相比,相對誤差為6.65%,且t檢驗的結(jié)果差異不顯著(P>0.05),說明該模型能夠真實反映變量與響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。

2.3 酸棗葉黃酮的體外抗氧化作用

由圖3a可知,在100～500 μg/mL內(nèi),酸棗葉黃酮的總還原力隨著樣品濃度的升高而增強(qiáng),其中113.03 μg/mL的酸棗葉黃酮的總還原力與60.00 μg/mL的VC相當(dāng),酸棗葉黃酮的總還原力約是VC的0.531倍,具有較強(qiáng)的總還原力;酸棗葉黃酮對DPPH自由基(圖3b)、ABTS自由基(圖3c)、羥自由基(圖3d)均具有清除作用,且存在劑量依賴關(guān)系,均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,由此可計算出酸棗葉黃酮對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)為111.51 μg/mL(VC的IC50為19.61 μg/mL),黃酮清除DPPH自由基的能力約是VC的0.176倍;黃酮對ABTS自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)為23.06 μg/mL(VC的IC50為15.70 μg/mL),黃酮清除ABTS自由基的能力約是VC的0.681倍;黃酮對羥自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)為253.73 μg/mL(VC的IC50為53.42 μg/mL),黃酮清除羥自由基的能力約是VC的0.211倍。綜上,酸棗葉黃酮具有良好的抗氧化活性。

圖3 酸棗葉黃酮的體外抗氧化活性

2.4 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲氧化損傷作用

2.4.1 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激作用的影響 如圖4所示,與對照組相比,經(jīng)過酸棗葉黃酮給藥培養(yǎng)后的N2線蟲的存活率均明顯提高,且存在顯著差異,50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮分別延長線蟲平均壽命11.70%、19.87%、38.95%,說明酸棗葉黃酮能有效提高線蟲對熱應(yīng)激的抵抗能力。

圖4 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲熱應(yīng)激作用的影響

2.4.2 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲H2O2氧化應(yīng)激作用的影響 如圖5所示,與對照組相比,酸棗葉黃酮能有效延長H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下N2線蟲的存活時間,且存在顯著差異,50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮分別延長線蟲平均壽命25.68%、42.82%、51.39%,說明酸棗葉黃酮能顯著增強(qiáng)線蟲對氧化應(yīng)激的抗性。

圖5 酸棗葉黃酮抗秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激作用的影響

2.4.3 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力和丙二醛含量的影響

2.4.3.1 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px酶活力的影響 如圖6所示,給藥組與空白組相比,GSH-Px酶活力不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的GSH-Px酶活力無顯著影響。35 ℃培養(yǎng)6 h后,GSH-Px酶活力顯著降低(40.25%),而50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮均能抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)GSH-Px酶活力減弱,且GSH-Px酶活力分別升高至43.50%、54.39%和75.90%,t-檢驗結(jié)果表明100、200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001),酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)GSH-Px酶活力降低。

圖6 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH-Px酶活力的影響

2.4.3.2 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD酶活力的影響 如圖7所示,給藥組與空白組相比,T-SOD酶活力和CuZn-SOD酶活力均不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的SOD酶活力無顯著影響。35 ℃培養(yǎng)6 h后,酶活力顯著降低,而酸棗葉黃酮能抑制氧化損傷線蟲體內(nèi)SOD酶活力的降低,且100 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在顯著差異(P<0.05),200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001),說明酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)SOD酶活力降低。

圖7 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD酶活力的影響

2.4.3.3 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)丙二醛含量的影響 如圖8所示,給藥組與空白組相比,MDA含量不存在顯著性差異,說明酸棗葉黃酮對正常情況下線蟲的MDA含量無顯著影響。35 ℃培養(yǎng)6 h后,MDA含量顯著升高(226.26%),而50、100和200 μg/mL酸棗葉黃酮均能抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)MDA含量升高,且MDA含量分別降低至211.03%、182.05%和156.62%。且100 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在顯著差異(P<0.05),200 μg/mL酸棗葉黃酮組和對照組之間存在高度顯著差異(P<0.001)。上述結(jié)果表明,酸棗葉黃酮可以有效抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)MDA含量的增加。

圖8 酸棗葉黃酮對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)MDA含量的影響

3 結(jié)論

本文采用超聲輔助法提取酸棗葉黃酮,在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計響應(yīng)面實驗,優(yōu)化酸棗葉黃酮提取工藝,得到最佳提取工藝條件為:液料比30.25∶1 mL/g、乙醇濃度79.00%、超聲功率301.00 W、超聲時間32.00 min。酸棗葉黃酮實際提取率為4.21%,與預(yù)測值4.51%擬合效果良好。制得的酸棗葉黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)分別為111.51、23.06和253.73 μg/mL,還原能力較強(qiáng),具有良好的體外抗氧化活性。酸棗葉黃酮能有效增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲對熱應(yīng)激、H2O2氧化應(yīng)激的抗性,抑制氧化損傷導(dǎo)致的線蟲體內(nèi)GSH-Px、SOD酶活力的降低,抑制MDA含量的增加,表現(xiàn)出良好的抗氧化損傷作用,具有廣闊的開發(fā)前景。