黃曉棠,姚妞妞,周 璇,郭潤芳,于宏偉

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

乳酸菌是發(fā)酵食品生產(chǎn)中一類重要的微生物,它們能改善發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)地,提高發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值,而且能產(chǎn)生一些特殊物質(zhì)來抑制食物腐敗細(xì)菌的生長,對調(diào)節(jié)免疫、維持腸道平衡和健康具有重要作用[1-3],因此乳酸菌膳食補(bǔ)充劑以及乳酸菌發(fā)酵食品越來越得到人們的青睞。乳酸菌是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品或動物腸道中分離而來,是安全性菌株(Generally recognized as safe,GRAS),因此人們更多關(guān)注的是乳酸菌的益生功能和健康應(yīng)用。

隨著抗生素的濫用,乳酸菌的抗藥性也逐漸成為公眾關(guān)注的安全問題,并引起了全世界專業(yè)學(xué)者的研究與重視,尤其是抗藥性的增加以及抗性基因?qū)χ虏【蚍侵虏【臐撛谵D(zhuǎn)移[4]。近年來,關(guān)于發(fā)酵食品中乳酸菌抗藥性的報(bào)道層出不窮,研究也取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),大部分乳酸菌對氨基糖苷類、喹諾酮類、多粘菌素B等抗革蘭陰性菌的抗生素有抗性[5],Li等[6]報(bào)道了19種乳酸菌對喹諾酮類抗生素的抗性,結(jié)果表明所有菌株均對諾氟沙星和環(huán)丙沙星有抗性,且喹諾酮抗性的遺傳基礎(chǔ)可能與gyrA基因的突變密切相關(guān)。Nawaz等[7]報(bào)道了分離自發(fā)酵食品中的乳酸菌攜帶ermB和tetM抗性基因,且可通過過濾器成功轉(zhuǎn)移到糞腸球菌中?？剐曰蛟诰曛g的相互傳遞具有一定的危害性[8],例如某些耐藥基因可能會以某種方式在腸道內(nèi)微生物菌群之間相互傳遞,從而導(dǎo)致某些致病菌也獲得了耐藥性[9]。

作為益生菌,植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌因優(yōu)良發(fā)酵特性及多種益生作用被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品發(fā)酵及醫(yī)療保健等領(lǐng)域[10-13],除了益生功能研究外,其耐藥性的相關(guān)研究也逐年增多[14-16]。本研究前期從自制混合發(fā)酵果蔬汁和樹莓酵素中分到2株植物乳桿菌,從奶制品中分離到干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌,并發(fā)現(xiàn)這些菌株對果蔬有良好的發(fā)酵特性[17]。因此,本文以這5株菌為研究對象,采用平板藥敏紙片擴(kuò)散法、PCR及RT-PCR技術(shù)從表型、耐藥基因定位及基因表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)的分析,為全面評價5株菌的安全性及其應(yīng)用價值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌S(LactobacillusplantarumS) 分離自蘋果、梨、香蕉混合發(fā)酵果蔬,命名為Z1,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室;植物乳桿菌WD(L.plantarumWD) 分離自樹莓酵素,命名為Z2;保加利亞乳桿菌LB-DR(L.bulgaricusLB-DR)、鼠李糖乳桿菌Lr-05-281(L.rhamnosusLr-05-281)、干酪乳桿菌D-400(L.caseiD-400) 分離自不同奶制品,分別命名為B1、L1、G1,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;27種藥敏紙片:氨基糖苷類(阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素)、喹諾酮類(諾氟沙星、氧氟沙星、左氟沙星、環(huán)丙沙星)、糖肽類(萬古霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素)、β-內(nèi)酰胺類(頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西啉、氨芐西林、苯唑西林、青霉素G、氨曲南)、磺胺類(復(fù)方新諾明)、其他(呋喃妥因、氯霉素、多粘菌素B、克林霉素) 杭州濱和微生物試劑有限公司;6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker 保定寶生物有限公司;Quick-RNA真菌/細(xì)菌Microprep試劑盒 ZYMO RESEARCH生物公司;HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

CP214型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;ABI-2720型PCR擴(kuò)增儀 賽默飛世爾科技有限公司;SPX-250S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;JY600C型電泳儀、JY04S-3E型電泳凝膠成像分析系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 從-20 ℃凍存管中取2%菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h,傳代2～3次,保證菌種活力。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法檢測5株乳酸菌對27種抗生素的敏感性,抗性判定參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)最新版手冊[18]進(jìn)行。

1.2.3 菌株基因組DNA的提取 采用傳統(tǒng)酚-氯仿的方法[19]提取5株乳酸菌的基因組DNA。

1.2.4 菌株質(zhì)粒的提取 采用張波等[20]高效提取乳酸菌質(zhì)粒的方法提取5株乳酸菌的質(zhì)粒。

1.2.5 抗藥基因的PCR檢測 根據(jù)乳酸菌抗藥性表型結(jié)果,NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找并下載抗性基因全序列,使用DNAMAN 5.0軟件(美國Lynnon Biosoft公司)進(jìn)行比對,選取同源性高的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì),共自行設(shè)計(jì)9對引物:卡那霉素抗性基因aph、慶大霉素抗性基因aacⅠ和aacⅡ、鏈霉素抗性基因ant(6)、四環(huán)素抗性基因tet、紅霉素抗性基因erm、萬古霉素耐藥基因vanⅠ和vanⅡ、β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaⅠ;而β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaⅡ、磺胺類抗性基因sul、喹諾酮類抗性基因qnr引自參考文獻(xiàn)[21-23]。設(shè)計(jì)的引物由北京華大基因公司合成,序列及退火溫度見表1。

表1 抗性基因引物序列及條件

分別以5株菌的基因組DNA和質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性45 s,相應(yīng)退火溫度45 s,72 ℃延伸45 s,72 ℃終延伸3 min,30次循環(huán)。擴(kuò)增體系為:DNA模板1 μL,上下引物(10 μmol/L)各1 μL,2×ES taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠(1.0%)點(diǎn)樣孔,120 V電泳40 min,電泳結(jié)束后紫外燈下觀察并拍照記錄。

1.2.6 抗性基因的表達(dá)分析 5株菌分別采用MRS和添加抗生素的MRS兩種培養(yǎng)基培養(yǎng),然后用Quick-RNA真菌/細(xì)菌Microprep試劑盒提取各菌株的總RNA,HiFiScript試劑盒對提取到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測抗性基因是否表達(dá);RT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株乳酸菌的藥敏反應(yīng)

由表2可見,5株菌的抑菌圈均在合理范圍之內(nèi),試驗(yàn)結(jié)果可靠。5株菌均表現(xiàn)為多重抗藥性,包括對氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類抗生素和多粘菌素B的抗性;但對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類抗生素和呋喃妥因敏感,有較為相似的耐藥譜,而對β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出不同程度的抗性,可見不同菌株的抗藥性是有差異的。

表2 5株菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

已有研究報(bào)道,Zhou等[24]檢測了4種益生乳酸菌的抗藥性,發(fā)現(xiàn)3株鼠李糖乳桿菌均對萬古霉素有抗性,對紅霉素、四環(huán)素敏感,與本研究一致。呂耀龍等[25]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中植物乳桿菌均對紅霉素敏感,而本研究中2株植物乳桿菌對紅霉素有不同的抗藥性,Z1對紅霉素表現(xiàn)為中介,Z2對紅霉素表現(xiàn)為敏感,由此可見,同種菌的不同菌株對同種抗生素的抗藥性不同,這可能由于菌株來源不同,所以其抗藥性也有差異。藥敏紙片擴(kuò)散法操作簡單、省時省力的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用,但影響結(jié)果的因素較多,如抗生素紙片的含藥量不同、培養(yǎng)基不同、菌體生長情況不同等。菌株對于同類抗生素的抗藥表型與攜帶的抗藥基因有一定的關(guān)聯(lián),因此,乳酸菌抗藥性的檢測還常常借助于特異性引物PCR方法。

2.2 抗性基因的遺傳定位

為了確定抗性基因是存在于基因組上,還是質(zhì)粒上,亦或者是二者均有,本試驗(yàn)分別以基因組DNA和質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果見圖1?；蚪M上共檢測到6個抗性基因(erm、aph、vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ和aacⅡ),質(zhì)粒上共檢測到4個基因(erm、aph、vanⅠ和aacⅠ),其它供試抗性基因(qnr、sul、ant(6)、tet、vanⅡ、blaⅠ)均未檢測到。對這5株菌而言,基因組上都檢測到erm、aph、vanⅠ、blaⅡ,B1、G1和L1這3株菌同時檢測到aacⅠ,L1還檢測到aacⅡ;至于aph基因擴(kuò)增片段大小不同,原因是不同的菌抗性基因本身大小不同所致。

圖1 5株菌的抗性基因PCR電泳圖譜

抗性基因在質(zhì)粒上的分布也不一致,其中菌株Z2質(zhì)粒上只檢測到vanⅠ,而L1質(zhì)粒上4種抗性基因都檢測到,另外3株菌質(zhì)粒上也分別有2～3種抗性基因。已有文獻(xiàn)表明,乳酸菌中存在接合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子,接合作用被認(rèn)為是乳酸菌獲得抗性基因的主要方式[26]。目前許多研究者都證實(shí)乳酸菌上的幾種抗性基因會在乳酸菌與同種菌株或其他菌株之間發(fā)生轉(zhuǎn)移[27],因此有待進(jìn)一步研究質(zhì)粒上的抗性基因是否會轉(zhuǎn)移到其他菌株上。如果僅在基因組DNA上檢測到,在質(zhì)粒上卻未檢測到,說明這個抗性基因可能是固有耐藥基因,不會發(fā)生水平轉(zhuǎn)移;但只要有抗性質(zhì)粒,就存在抗性質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的可能性,因此,相較于其它供試菌株,Z2菌株在抗藥性方面更具安全性。

2.3 抗性基因與表型的關(guān)系

表3總結(jié)了抗生素抗性與相關(guān)抗性基因之間的關(guān)系,菌株攜帶的抗藥基因與抗藥表型之間有一定關(guān)聯(lián)。如5株菌對卡那霉素、萬古霉素有抗性,且檢測到aph、vanⅠ,5株菌對復(fù)方新諾明敏感,且未檢測到sul,表型與基因型結(jié)果一致。

表3 抗生素抗性與相關(guān)抗性基因之間的關(guān)系

然而,在部分抗藥菌株中并沒有檢測到相應(yīng)的抗藥基因,本研究中5株菌對喹諾酮類抗生素、鏈霉素有抗性,卻未檢測到相應(yīng)的抗性基因,分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是5株菌對鏈霉素或喹諾酮類抗生素的抗性可能是抗性基因檢測不夠全面,有其他或新的抗性基因?qū)е戮昃哂锌顾幮?還可能是這個抗性基因在某種特定條件下才會表達(dá)等其他原因。類似的結(jié)果之前也有文獻(xiàn)報(bào)道,Hummel等[28]研究了45種乳酸菌的抗藥性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌BFE 7440對氯霉素有抗性,卻未檢測到氯霉素抗性基因cat;Rojo-Bezares等[29]研究了酒中乳酸菌的耐藥性,研究表明植物乳桿菌C709對萬古霉素有抗性,也未檢測到相關(guān)抗性基因。另外,表型敏感的菌株也可能攜帶抗性基因,本研究中4株菌對紅霉素敏感,卻都檢測到紅霉素抗性基因erm。秦宇軒等[30]檢測了酸奶中分離出的乳酸菌的抗藥性,研究表明干酪乳桿菌對四環(huán)素敏感,但在干酪乳桿菌中檢測到四環(huán)素抗性基因tetK、tetM。這可能是因?yàn)槠鋽y帶的抗性基因沉默所致。

5株菌對不同的β-內(nèi)酰胺類抗生素有不同的敏感性,對頭孢菌素類抗生素、哌拉西林、氨芐西林有較高的敏感性,對苯唑西林、青霉素G、氨曲南有較高的抗性,5株菌均檢測到β-內(nèi)酰胺類抗性基因blaⅡ而未檢測到blaⅠ,分析原因可能是抗性基因blaⅡ?qū)е戮甑目顾幮浴?/p>

2.4 抗性基因的表達(dá)分析

抗性基因能否表達(dá)也是其評價指標(biāo)之一,針對檢測到的6種抗性基因進(jìn)行了RT-PCR。試驗(yàn)采用了MRS培養(yǎng)和抗生素誘導(dǎo)培養(yǎng)兩種方式,從而進(jìn)一步證明抗性基因的表達(dá)條件。氨基糖苷類抗生素選取慶大霉素、卡那霉素,糖肽類抗生素用萬古霉素,大環(huán)內(nèi)酯類用紅霉素,β-內(nèi)酰胺類抗生素用青霉素G。除了紅霉素誘導(dǎo)不長菌之外,其余抗生素誘導(dǎo)都長菌。

由表4可見,對aph抗性基因來說,植物乳桿菌Z2菌株與其它四種菌表現(xiàn)不同,用MRS培養(yǎng)基上卡那霉素抗性基因aph表達(dá),用添加卡那霉素后其aph基因不表達(dá);對vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ和aacⅡ4種抗性基因而言,5株菌在MRS培養(yǎng)基和添加抗生素的MRS培養(yǎng)基中的表達(dá)情況一致,表達(dá)的仍舊表達(dá),不表達(dá)的依然不表達(dá),由此說明沉默的抗性基因在誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下依然沉默,這些沉默的抗性基因可能在特定的條件下才能被激活表達(dá),這個特定的表達(dá)條件有待進(jìn)一步研究。

表4 抗性基因表達(dá)檢測結(jié)果

3 結(jié)論

5株菌均表現(xiàn)出對氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類抗生素和多粘菌素B的多重抗藥性。其耐藥基因型分別為:Z1和Z2為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr,B1和G1為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr、aacⅠr,L1為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr、aacⅠr、aacⅡr。5株菌質(zhì)粒上所含的抗藥基因數(shù)量不同,Z2菌株質(zhì)粒上因只含一種vanⅠ抗性基因,其應(yīng)用安全性較好。

另外,質(zhì)粒上的抗性基因可能存在轉(zhuǎn)移到其他菌株的風(fēng)險。目前關(guān)于乳酸菌耐藥性的研究多在耐藥表型、耐藥基因檢測及耐藥機(jī)制等方面,我們也應(yīng)多研究如何消除耐藥基因及消除耐藥基因后乳酸菌益生性能有無變化。因此,要加強(qiáng)對乳酸菌抗藥性的研究,進(jìn)一步研究消除耐藥基因后乳酸菌的益生性變化,從而保障發(fā)酵食品的質(zhì)量安全,同時為發(fā)酵食品企業(yè)評估菌株的抗藥性提供理論基礎(chǔ)。