劉德講,陳計巒,裴龍英

(1.信陽市質量技術監(jiān)督檢驗測試中心,河南信陽 464000;2.石河子大學,新疆石河子 832003;3.新疆理工學院,新疆阿克蘇 843000)

在近些年的食品加工中,傳統的熱處理方式對熱敏性食品以及食品中的酶、營養(yǎng)物質影響較大,非熱加工技術日漸應用到食品生產中。尤其是超高壓技術,相比與其他的非熱加工技術,其商業(yè)化程度更高且應用最廣的一種技術。超高壓加工的草莓醬可以保留95%的氨基酸,而熱加工處理的草莓醬營養(yǎng)物質損失嚴重且有異味[1]。Liu等[2]研究了高壓(300～600 MPa)和高溫瞬時(110 ℃/8.6 s)對芒果中抗氧化能力、糖類、有機酸、顏色等的影響,發(fā)現高壓處理的芒果中維生素C、抗氧化能力、顏色等均比高溫瞬時處理的樣品接近新鮮芒果。在過去十幾年中,美國、日本、法國、德國和英國等國家系統地研究了超高壓處理對食品材料的性質、酶、風味、顏色和微生物的影響。

超高壓可使酶被激活或者鈍化,從而影響酶在香氣合成途徑中的作用,進而影響前體物質在香氣物質之間的轉化,最后使得果蔬整體的香氣物質含量種類發(fā)生改變,從而改善風味[3]。揮發(fā)性成分的代謝途徑復雜,主要以氨基酸代謝和脂肪酸代謝為主,新鮮水果和蔬菜的主要代謝風味物質是酯類、醇類和醛類等。在氨基酸代謝和脂肪酸代謝過程中主要的酶有氫過氧化物裂解酶(HPL)、磷脂酶(PLA)、脂氧合酶(LOX)、乙醇脫氫酶(ADH)、?；D移酶(AAT)等。LOX酶主要參與以脂肪酸為前體的直鏈酯的合成[4];ADH和AAT主要將醛轉化為醇以及醇轉化成酯,同時,這種反應是可逆的反應[5-7]。磷脂酶是一類將非水合磷脂水解成脂肪酸和水合磷脂的酶,也是脂肪酶的一種。在不同的條件加工過程中,酶活性、底物的結構和濃度、pH、溫度均會發(fā)生改變,不同處理條件下香氣成分和風味酶的變化有其本身的特點和規(guī)律。Lambadarios等[8]報道在超高壓過程中或解壓以后殘存酶活對實際果實系統可能有一個促進影響。

本文分析350～500 MPa壓力的超高壓處理、熱處理(微波處理MW、高溫處理TP)、空白組(CK)對果蔬中四種香氣合成相關酶(脂氧合酶(LOX)、乙醇脫氫酶(ADH)、磷脂酶A2(PLA2)、?；D移酶(AAT))的活性、結構(一級、二級和三級)以及之間相關性的影響,以期為以后改善香氣和加工方式提供理論依據,同時使加工過程中原有風味得到最大限度的保留,提高商品價值,對精深產品的開發(fā)提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耐高壓塑料包裝袋、ELISA檢測試劑盒、MES、Tris、NADH、磷酸鉀、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、丙烯酰胺、β-巰基乙醇、溴酚藍、甘氨酸等試劑 均為分析純,購于沃德生物有限責任公司;脂肪氧合酶(LOX,5 kU)、?；D移酶(AAT,15 kU)、乙醇脫氫酶(ADH,15 kU)、磷脂酶A2(PLA2,1.5 kU)和亞油酸(LA) 美國sigma公司。

CBM-20A紫外分光光度計 日本島津公司;Bio-rad Powerpac Universal SDS-PAGE電泳儀 美國Bio-Rad公司;MOS-450圓二色譜儀 法國MOS公司;HITACHIF-3500熒光分光光度計 日本日立公司;M1-L213B微波爐 美的集團;HH-42恒溫油浴鍋 常州國華電器有限公司;HPP.L.2-600/0.6超高壓設備 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;PHSJ-4F pH計 山東晨拓科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 酶液的制備 LOX用0.05 mol/L pH9.0硼酸緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;AAT用0.20 mol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;ADH用0.20 mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;PLA2用0.20 mol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液。

1.2.1.2 樣品的處理 微波處理(MW)[9]:將30 mL 1.2.1.1制備好的各酶液放入滅菌的錐形瓶中并密封,采用微波功率600 W加熱45 s后取出,迅速用流動自來水冷卻到室溫。

高溫處理(TP)[10]:將1.2.1.1中制備的30 mL酶液置于帶塞試管中,在121 ℃恒溫油浴鍋中加熱45 s,迅速用流動自來水冷卻至室溫。

超高壓處理[11]:將30 mL 1.2.1.1酶液放入真空包裝袋中,真空包裝機真空密封。超高壓處理設定4個壓力梯度:350、400、450、500 MPa;溫度:45 ℃;保壓時間:15 min,水為傳壓介質。通過循環(huán)泵將壓力釜和水的溫度加熱到45 ℃。將樣品置于高壓釜內,調整高壓釜內水位,開始處理。所有處理好的樣品均放入冰箱中冷藏備用,放置時間小于4 h。

1.2.2 酶活性的測定

1.2.2.1 LOX的測定 參照宋麗軍[12]的方法有稍微的改動。制備LOX底物亞油酸溶液:60 μL亞油酸,120 μL吐溫20,4 mL蒸餾水,混勻后再加入60 μL 5.00 mol/L氫氧化鈉溶液,充分搖勻至溶液澄清,定容至25.00 mL,置于冰箱冷藏備用。

活性測定:2.88 mL 0.05 mol/L pH9.0硼酸緩沖液,0.10 mL亞油酸溶液,最后加入0.02 mL酶液并混合均勻后。以硼酸緩沖液作對照。室溫下在234 nm的波長處測定吸光度的變化(每隔20秒記錄一次,共記錄3 min),重復實驗3次。

1.2.2.2 ADH的測定 根據Ke等[13]描述的方法稍加改動。3.00 mL反應體系中包含2.40 mL 0.10 mol/L MES-Tris緩沖液(pH6.5),0.15 mL 1.60 mmol/L NADH,0.15 mL 80.00 mmol/L乙醛,0.30 mL酶液,MES-Tris緩沖液作為對照,室溫下于340 nm波長處測定OD值變化,加酶液15 s后開始計時,記錄1 min內數值的變化,重復3次。

1.2.2.3 AAT和PLA2的測定 AAT和PLA2使用ELISA檢測試劑盒(Shangle,Shanghai,China)按照制造商的說明進行測定活性。

酶活性定義:單位時間內,1.00 mL酶液吸光度變化0.001定義為1個酶活性單位(U)。

1.2.3 一級結構的測定 采用SDS-PAGE檢測酶的一級結構。

10%分離膠配制:5.90 mL去離子水;5.00 mL丙烯酰胺貯備液;3.80 mL分離膠緩沖液;0.15 mL 10% SDS;0.15 mL 10%過硫酸銨;0.006 mL TEMED;總體積15 mL。

5%濃縮膠配制:3.40 mL去離子水;0.83 mL丙烯酰胺貯備液;0.63 mL濃縮膠緩沖液;0.05 mL 10% SDS;0.05 mL 10%過硫酸銨;0.005 mL TEMED;總體積5 mL。

注入10%的分離膠,待分離膠聚合后,在其上方注入5%的濃縮膠。按預定順序加樣,每孔上樣量20 μL,開始電泳。電泳時濃縮膠電壓為60 V,分離膠電壓為80 V。電泳結束后取出膠片,采用考馬斯亮藍染液進行染色,室溫下染色時間1～1.5 h。染色后取出膠片置于甲醇-冰醋酸脫色液中脫色10～12 h至凝膠背景清楚,其間更換多次脫色液。

1.2.4 二級結構的測定 利用圓二色譜測定二級結構。四種酶液的光譜掃描波長范圍全采用全波長掃描,在室溫下進行四次重復掃描。圖譜經過儀器本底消除和溶液空白差減。掃描速度為20 nm/min,時間常數為2.0 s,帶寬為1.0 nm。每種酶液的緩沖液分別作為空白校正數據。圓二色性以平均摩爾橢圓率(θ,deg·cm2/mol)表示。CD光譜采用K2D軟件來分析所有酶的二級結構組成。

1.2.5 三級結構的測定 采用熒光光譜法檢測酶的三級結構。先用蒸餾水進行儀器校準,LOX酶的激發(fā)波長λex=285 nm,掃描范圍200～400 nm,靈敏度為6,狹縫為10 nm。AAT酶的激發(fā)波長λex=412 nm,掃描范圍300～600 nm,靈敏度為5,狹縫為10 nm。ADH酶的激發(fā)波長λex=295 nm,掃描范圍300～500 nm,靈敏度為2,狹縫為10 nm。PLA2酶的激發(fā)波長λex=280 nm,掃描范圍290～450 nm,靈敏度為4,狹縫為10 nm。四種酶均在室溫下測定,重復掃描三次。

1.3 數據處理

使用SPASS 17.0進行數據分析,且所有實驗均有三組平行試驗。繪圖采用Origin 8.5。熱圖和相關性分析采用R語言中Complex Heatmap包。

2 結果與分析

2.1 超高壓和熱處理對LOX的影響

2.1.1 超高壓和熱處理對LOX活性的影響 由圖1可以看出,經過不同壓力和熱處理后LOX活性均顯著降低(P<0.05),且在超高壓組內隨著壓力的增加呈降低的趨勢,450和500 MPa處理的樣品間的酶活性差異不顯著(P>0.05)。兩種熱處理的LOX活性均顯著低于超高壓處理,TP組比空白組下降了61%。

圖1 不同處理方式下LOX活性的變化

Rodrigo等[14]通過對番茄汁中的LOX酶研究發(fā)現,除高溫失活外,在較高壓力下例如550 MPa/12 min或600 MPa/10 min,LOX會失去更多活性,這與本實驗結果類似。Apichartsrangkoon等[15]發(fā)現LOX在300～500 MPa壓力下活性會降低。在對超高壓處理的哈密瓜汁研究中有類似結果,壓力大于300 MPa時LOX酶活性被抑制[12]。

2.1.2 超高壓和熱處理對LOX一級結構的影響 LOX酶一級結構變化如圖2所示,經過不同條件處理的LOX酶均只有一條條帶,說明四種超高壓處理和兩種熱處理均沒有導致LOX分子肽鏈的斷裂,也就是說LOX的一級結構沒有發(fā)生變化。該結果與多種研究[12,16-17]相同,通過不同壓力和溫度對LOX進行研究發(fā)現,壓力和溫度都沒有改變LOX酶的一級結構。

圖2 不同處理后LOX的SDS-PAGE電泳圖

2.1.3 超高壓和熱處理對LOX二級結構的影響 從表1可以看出,與空白組對比,經過不同處理后,α-螺旋的含量均減少,500 MPa樣品下降最顯著(P<0.05)。與空白組對比,隨著壓力的增加β-折疊含量呈顯著增加的趨勢,而微波處理的樣品β-折疊含量顯著下降(P<0.05)。除了400 MPa樣品中無規(guī)則卷曲的含量有輕微的下降,經過不同處理后β-轉角和無規(guī)則卷曲的含量均出現增加趨勢,其中微波處理增加最顯著(P<0.05)。

表1 不同處理后LOX二級結構含量的變化

王幫國[16]研究了超高壓對LOX酶二級結構的影響,結果顯示壓力從150 MPa以50 MPa為梯度增加到400 MPa時,α-螺旋、β-折疊含量明顯下降,并且隨著壓力增加,二級結構變化顯著。與本實驗結果有所差異的原因,可能是原材料和壓力的取值不同。

2.1.4 超高壓和熱處理對LOX三級結構的影響 從圖3中可以看出,空白組的熒光值最低,經過不同處理后熒光值均有所增加;超高壓處理組隨著壓力的增加熒光強度呈增加的趨勢,350與500 MPa相比峰向長波方向偏移,500 MPa樣品在312 nm出現最高峰,峰值為496.64;TP處理在所有處理中熒光值最大,為569.09。以上可知,不同處理方式對LOX分子熒光強度的影響不同,造成這種現象的原因可能是壓力和溫度對一些芳香族殘基例如色氨酸、酪氨酸有一定影響,使得這些氨基酸不斷由分子內非極性環(huán)境中暴露在外部極性環(huán)境中,造成熒光強度明顯增強。宋麗軍[12]研究發(fā)現,不同壓力和溫度對LOX酶的熒光強度有影響,熒光強度隨著壓力的增加逐步增加,且溫度對LOX酶的熒光強度也有顯著影響，與本結論相似。

圖3 不同處理后LOX的熒光光譜圖

2.2 超高壓和熱處理對ADH酶的影響

2.2.1 超高壓和熱處理對ADH酶活性的影響 由圖4可知,經過超高壓和熱處理后,ADH酶的活力有不同程度的增加(超高壓500 MPa除外)。其中,TP樣品增加最顯著,達到了23.8 U/mL(P<0.05)。酶的活化原因可能是:第一,酶構象的可逆性或發(fā)生酶促反應的活性位點發(fā)生重排[18];第二,在增加壓力后,距離基質近的酶的靈敏度可能增加;第三,在高壓力條件下,溶劑被壓縮使得反應速率增快,底物濃度可能會增大[19]。高壓組內,隨著壓力的增大,400和500 MPa樣品ADH的活力呈下降趨勢,350和450 MPa樣品間酶活力變化不顯著(P>0.05),但500 MPa樣品的活性急劇下降,值為12.7 U/mL,急劇下降的原因可能是壓力達到了較高水平。

圖4 不同處理方式下ADH活性的變化

酶活性的變化不僅與壓力、溫度、作用時間等外界環(huán)境密切相關,與其本身特性和內在原因也有較大關系,例如香蕉中乙烯含量與ADH活性成正相關[20],甜柿成熟前期可溶性單寧含量增加,ADH活性增加,果實脫澀后,ADH活性又出現降低現象[21]。

2.2.2 超高壓和熱處理對ADH一級結構的影響 從圖5可以看,經過不同條件處理的ADH有且只有一條條帶,說明4種超高壓處理和2種熱處理都沒有導致ADH分子肽鏈的斷裂,即超高壓處理和熱處理的ADH酶一級結構沒有發(fā)生改變。

圖5 不同處理后ADH的SDS-PAGE電泳圖

2.2.3 超高壓和熱處理對ADH二級結構的影響 由表2可以看出不同處理條件下ADH的二級結構的變化?？瞻捉M中α-螺旋的含量為9.1%,400 MPa時,α-螺旋的含量急劇降到了0.2%。TP處理中α-螺旋的含量恰好相反,出現顯著的增加,在所有處理中α-螺旋的含量最高,可能是較高溫度所導致的。超高壓組的β-折疊的變化與α-螺旋的變化趨勢相似。超高壓組β-轉角的變化與空白相比,350和500 MPa樣品的含量均有所增加,而450 MPa變化不顯著(P>0.05)。隨著壓力增加,與空白組對比,β-轉角有不同程度的增加(450 MPa除外)。在微波處理中β-轉角的含量只有2%,是所有處理中最低。無規(guī)則卷曲的變化比較多樣,微波加熱中無規(guī)則卷曲的含量最高,達到了90%。推測可能是較高的溫度導致維持ADH酶分子立體構象的部分次級鍵斷裂或者不穩(wěn)定,導致其構象進一步崩潰。

表2 不同處理后ADH的二級結構含量變化

2.2.4 超高壓和熱處理對ADH三級結構的影響 圖6是ADH酶經過不同處理后的熒光光譜圖，經過不同方式處理后ADH的熒光強度均有所降低。CK組的熒光峰值最大,為238.23,其次是微波處理;超高壓處理組中,500 MPa熒光峰值最大,其次是350、450、400 MPa,且峰位有不同程度的偏移,其中350 MPa處理的樣品與400和450 MPa樣品比較,出現了341～351 nm處向右10 nm的最大偏移。出現偏移主要是因為壓力和溫度的存在,與蛋白質濃度無關[22]。超高壓處理與熱處理對比發(fā)現,兩種加熱處理的ADH酶熒光強度高于350～450 MPa的熒光強度。

圖6 不同處理后ADH的熒光光譜圖

2.3 不同超高壓和熱處理對AAT的影響

2.3.1 不同超高壓和熱處理對AAT活性的影響 由圖7可以看出,空白組樣品的AAT酶活力最高,為27.93 U/mL。經過不同壓力和熱處理后AAT酶活力均出現不同程度的降低。超高壓組中,400 MPa樣品的活力最大達到了25.5 U/mL,其后依次是350、500、450 MPa的酶活。熱處理組中TP樣品的AAT活性顯著降低(P<0.05)。

圖7 不同處理方式下AAT活性的變化

2.3.2 超高壓和熱處理對AAT一級結構的影響 從圖8中可以看,經過不同條件處理的AAT酶有且只有一條條帶,說明4種超高壓處理和2種熱處理均沒有導致AAT分子肽鏈的斷裂,也就是說不同壓力的超高壓處理和不同的熱處理方式均沒有改變AAT酶的一級結構。

圖8 不同處理后AAT的SDS-PAGE電泳圖

2.3.3 超高壓和熱處理對AAT二級結構的影響 由表3可知,與空白組相比,350、400、500 MPa和TP處理中α-螺旋含量有顯著提高(P<0.05),450 MPa和MW處理中α-螺旋含量有顯著減少(P<0.05),MW樣品中α-螺旋含量最少僅有2.8%。β-折疊的變化與空白組相比,450 MPa和微波處理中β-折疊有顯著增加,含量分別為45.9%和49.0%,而TP處理下降最明顯,含量僅有0.3%。無規(guī)則卷曲經過不同處理后均有不同的降低。從整體來看,350、500 MPa以及TP處理的變化主要以α-螺旋為主,而450 MPa和MW處理主要以β-折疊的為主。

表3 不同處理后AAT的二級結構含量變化

2.3.4 超高壓和熱處理對AAT三級結構的影響 由圖9可以看出,以空白組為分界線,超高壓處理組的熒光光譜均在空白組之上,兩種熱處理均在空白組之下,即經過不同高壓處理增強了AAT酶的熒光強度,且峰位均向左有不同程度的偏移,而經過熱處理后減弱了AAT酶的熒光強度,但峰位沒有發(fā)生偏移。原因可能是,超高壓處理破壞了酶分子中鍵的連接模式,拉遠了酶分子中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基等氨基酸之間的距離,使酪氨酸無法再把其能量通過共振形式傳遞給色氨酸,從而使熒光強度改變[23]。

圖9 不同處理后AAT的熒光光譜圖

2.4 不同超高壓和熱處理對PLA2的影響

2.4.1 不同超高壓和熱處理對PLA2活性的影響 從圖10可以看出,經過超高壓和加熱處理后,PLA2活力呈現逐漸降低的趨勢(P<0.05)。在超高壓組中,隨著壓力的增加整體也呈現降低的趨勢,熱處理組中TP樣品在所有處理中酶活性最低(P<0.05)。Suladze等[24]使用傅里葉紅外光譜分析了PLA2的活性,結果與本實驗相似,均表明較大壓力會降低PLA2酶的活性,其原因分析可能是較強的壓力使酶與底物結合的狀態(tài)受到破壞導致的。

圖10 不同處理方式下PLA2活性的變化

2.4.2 超高壓和熱處理對PLA2一級結構的影響 如圖11是PLA2在7種條件下的SDS-PAGE電泳圖,經過不同條件處理的PLA2酶液有且只有一條條帶,說明無論是超高壓處理還是熱處理均沒有使PLA2分子肽鏈斷裂,也就說明超高壓處理和熱處理均沒有改變PLA2酶的一級結構。通常,通過幾次共價相互作用構建的酶的一級結構在加壓時不受影響。高壓通過改變靜電和疏水相互作用以及氫鍵影響酶的三級和四級結構[25]。Hayakawa等[26]通過其β-螺旋含量和示差掃描量熱法(DSC)吸熱焓的降低來證實,壓力處理只有構象變化,因為沒有觀察到PAGE圖譜的變化。

圖11 超高壓和熱處理處理后PLA2的SDS-PAGE電泳圖

2.4.3 超高壓和熱處理對PLA2二級結構的影響 由表4可知,空白組中80%都是α-螺旋和β-折疊這兩種結構。經過不同壓力和熱處理處理后,α-螺旋和β-折疊含量均顯著降低(P<0.05)。β-轉角的變化與α-螺旋和β-折疊的變化相反,經過高壓和熱處理后β-轉角的含量都有不同程度的升高,其中MW處理后β-轉角的含量在所有處理中最高,達到了30.7%。無規(guī)則卷曲的變化與β-轉角變化相似,經過高壓和熱處理后β-轉角的含量都有不同程度的升高。Suladze等[24]使用高壓停流熒光光譜研究高壓對PLA2的結構進行研究,結果顯示PLA2與生物膜的結合不受壓力的顯著影響,但可以鈍化酶的活性,α-螺旋結構隨著壓力增加而減少。

表4 不同處理后PLA2的二級結構的變化

2.4.4 超高壓和熱處理對PLA2三級結構的影響 圖12是PLA2酶經過不同的方式處理后的熒光光譜圖,不同的處理方式PLA2酶的熒光強度和峰位都發(fā)生了不同程度的改變,但是峰型沒有變化?？瞻捉M在336 nm處有熒光最大值為830.93,經過不同高壓處理和熱處理后熒光強度都有所降低,且熱處理組均低于超高壓處理組。在超高壓處理組中,壓力350～450 MPa熒光強度呈現降低的趨勢,且隨著壓力升高，出現了向短波方向偏移的現象。推測其原因可能是超高壓增強了色氨酸殘基和酪氨酸殘基的疏水特性,出現向短波方向偏移現象[27]。

圖12 不同處理后PLA2的熒光光譜圖

2.5 超高壓和熱處理條件下四種酶活性與結構的相關性分析

由表5可以看出,經過超高壓和熱處理后,LOX和PLA2活性均與α-螺旋呈顯著正相關;超高壓組的LOX與熱處理組的ADH均與β-折疊呈顯著負相關,相關系數分別是0.935(P<0.01)、0.851(P<0.05);熱處理組的LOX和超高壓處理組的AAT與β-轉角相關較強(P<0.01),相關系數分別是-0.960、0.776;超高壓組的LOX與熱處理組的PLA2均與無規(guī)則卷曲有顯著負相關(P<0.05);不同處理的LOX、PLA2以及超高壓處理的ADH均與熒光強度有顯著相關。

表5 不同處理中四種酶活性與結構的相關性分析

酶是大分子，通常具有多級結構,分子結構的變化與活性的關系密切相關[28]。超高壓處理是一種高強度動力作用,可能會破壞酶分子的高級結構并影響到活性。在對草莓汁的研究中也得出類似結論,酶空間結構的改變對酶活性有較大影響[29]。鐘葵等[30]采用高壓脈沖電場對LOX酶構象的研究發(fā)現,隨著電場強度的增強,LOX酶分子中α-螺旋含量及酶活性降低,β-折疊含量增加,且與α-螺旋及β-折疊的含量呈良好的線性關系(R2>0.900)。Dallet等[31]發(fā)現酵母醇脫氫酶(YADH)的活性通過壓力的增加而持續(xù)被抑制,同時不同壓力對酶熒光強度有一定影響,進而對活性產生正面或負面影響。邱春江[17]發(fā)現溫度大于70 ℃,LOX的α-螺旋、β-折疊含量降低,逐漸變成松散狀態(tài),進一步導致LOX變性,酶活降低,這與本實驗結論類似。胡國洲[32]研究微波處理后活性與β-折疊含量又較強相關性。涂宗財等[33]研究得出蛋白質的微觀結構與加工壓力有關,圓二色譜顯示了卵清蛋白在經過不同壓力加工后α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲之間發(fā)生相互轉化,且與活性有較大的相關性。

3 結論

超高壓處理和熱處理對LOX、ADH、AAT、PLA2酶的活性與二、三級結構有較大影響。其中隨著壓力的增加和不同的熱處理LOX、AAT、PLA2酶活性降低,ADH活性升高;LOX經過超高壓處理后α-螺旋含量明顯降低,但熒光強度均高于對照組,活性與結構相關性分析中也顯示α-螺旋、熒光強度均與LOX活性有強相關;ADH酶的熒光強度均低于對照組,活性與熒光強度有較大負相關;超高壓處理后AAT的熒光強度均高于對照組,熱處理組中AAT的熒光強度均低于對照組;經過超高壓和熱處理后PLA2酶α-螺旋含量有不同程度的降低,活性主要與α-螺旋、熒光強度有強烈相關性。