史有陽 郝 煒 吳春宇 韓向暉 楊 瑞 孫霃平 劉 勝

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合乳腺科，上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)外科研究所，上海200032）

阿霉素是蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物，臨床上廣泛用于治療惡性腫瘤，具有高效、廣譜的特點(diǎn)，但其多種毒副反應(yīng)特別是心臟毒性使其在臨床應(yīng)用上受到限制[1]。課題組前期臨床研究表明，中藥桔梗能夠改善乳腺癌患者阿霉素化療后心臟毒性，提高患者心臟射血功能[2]。本實(shí)驗(yàn)選用心臟特異表達(dá)綠色熒光轉(zhuǎn)基因Tg（cmlc2：EGFP）斑馬魚，借助熒光顯微鏡可以全程觀察其心臟發(fā)育及血液流動(dòng)狀況[3-4]。通過不同濃度的阿霉素干預(yù)，建立阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷模型，并進(jìn)一步觀察桔梗提取物對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 心臟特異表達(dá)綠色熒光轉(zhuǎn)基因Tg（cmlc2：EGFP）斑馬魚由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供，實(shí)驗(yàn)全程遵循斑馬魚實(shí)驗(yàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理要求，研究通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)前一晚將成年雌雄斑馬魚按1∶2 配對(duì)，放入帶隔板的產(chǎn)卵盒中，第2 天早晨抽掉隔板。產(chǎn)卵完成1 h后，用吸管將魚卵收集于含有胚胎培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中，清洗魚卵數(shù)次除去未受精卵、糞便等雜物，將發(fā)育完整的受精卵放于28.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每24 h換液1次。

1.2 藥品、試劑與儀器 阿霉素（購自碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)SC0159）；中藥桔梗飲片（購自上海養(yǎng)和堂飲片有限公司，批號(hào)171012）；木犀草素（購自成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-17102605）；普 通 倒 置 顯 微 鏡（SMZ745，Nikon）；熒光倒置顯微鏡（SMZ18，Nikon）；微量電子分析天平（BAS224S，德國Startotius）；安捷倫Agilent 1260 Infinity液 相 色 譜 儀（美 國Agilent）；N-1300D-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 稱取桔梗飲片10.0 g，加入120 mL 70%乙醇溶液浸泡4 h后回流提取1 h，過濾，收集濾液。重復(fù)2 次后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 g/mL，過0.45 μm微孔濾膜，收集濾液，-20 ℃分裝保存，用時(shí)稀釋至所需濃度。同時(shí)，通過高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，測(cè)定桔梗提取物中木犀草素含量為2.85 mg/g，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，色圖譜見圖1。

圖1 桔梗提取物高效液相色譜圖

2.2 阿霉素誘導(dǎo)斑馬魚心臟損傷模型的建立 選取發(fā)育正常，受精后48 h的斑馬魚20 條，放置于24孔板中，隨機(jī)分為4 組，分別為正常組和阿霉素低、中、高 劑 量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）組，每組5 條。各組斑馬魚放入28.5 ℃的培養(yǎng)箱中，分別加入含不同濃度阿霉素的胚胎培養(yǎng)液，正常組加入不含阿霉素的胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。普通倒置顯微鏡觀察各組斑馬魚心臟形態(tài)，計(jì)算生存率。將各組斑馬魚放于4%甲基纖維素中，擺放于側(cè)臥位，熒光倒置顯微鏡下觀察，記錄心率，測(cè)量靜脈竇-動(dòng)脈球（SV-BA）距離。最終選擇合適濃度的阿霉素，以建立斑馬魚心臟損傷模型。

2.3 斑馬魚對(duì)桔梗提取物的耐受試驗(yàn) 選取160條狀態(tài)良好，受精后48 h的斑馬魚放入24孔板中，隨機(jī)分為8組，每組20條。采用等比濃度梯度稀釋法，用胚胎培養(yǎng)液稀釋桔梗提取物至20、40、80、160、320、640、1 280 μg/mL，以空白培養(yǎng)液為對(duì)照組。加藥完成后放入28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察斑馬魚的生存情況，計(jì)算生存率。

2.4 桔梗提取物對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷的影響 選取25條發(fā)育正常，受精后48 h的斑馬魚放入24孔板中，隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組和桔梗提取物低（20 μg/mL）、中（40 μg/mL）、高（80 μg/mL）劑量組，每組5條。除正常組外，其余各組斑馬魚使用阿霉素制作心臟損傷模型。造模后分別予相應(yīng)濃度的桔梗提取物干預(yù)24 h，使用普通倒置顯微鏡觀察各組斑馬魚心臟形態(tài)，使用熒光倒置顯微鏡觀察斑馬魚心臟收縮和舒張形態(tài)，記錄和計(jì)算各項(xiàng)心臟功能指標(biāo)，包括心率、SV-BA距離、每搏輸出量、心輸出量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 斑馬魚心臟損傷模型制作中阿霉素用量 經(jīng)低、中、高劑量（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L）阿霉素及不使用阿霉素作用24 h，斑馬魚生存率均為100%。正常組斑馬魚活動(dòng)力強(qiáng)，無心包水腫；中、高劑量阿霉素干預(yù)24 h后，斑馬魚活動(dòng)力受到抑制，心房、心室逐漸變大，出現(xiàn)不同程度的心包水腫，其中高劑量阿霉素組斑馬魚心包水腫尤為嚴(yán)重。見圖2。與正常組斑馬魚相比，中、高劑量阿霉素組斑馬魚心率明顯下降（P＜0.05）、SV-BA距離顯著增大（P＜0.05），見表1。考慮10 μmol/L阿霉素毒性適中，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取10 μmol/L阿霉素誘導(dǎo)斑馬魚心臟損傷，建立心臟損傷模型。

圖2 阿霉素干預(yù)后各組斑馬魚心包及心臟表型比較

3.2 桔梗提取物對(duì)斑馬魚的安全劑量 桔梗提取物1 280 μg/mL組斑馬魚全部死亡，640、320、160、80、40、20 μg/mL組 斑 馬魚存活率分別為90.0%、100.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、1 0 0.0%、100.0%。斑馬魚對(duì)桔梗提取物的最大耐受劑量為320 μg/mL。因此，在安全劑量范圍內(nèi)選擇20、40、80 μg/mL這3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 桔梗提取物對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷的影響 與正常組比較，模型組斑馬魚心包出現(xiàn)水腫；與模型組比較，中、高劑量桔梗提取物干預(yù)24 h后，斑馬魚心包水腫減輕。見圖3。與正常組比較，模型組斑馬魚心率明顯降低（P＜0.05），SV-BA距離增大（P＜0.05），每搏輸出量、心輸出量均顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)中、高劑量桔梗提取物干預(yù)24 h，斑馬魚心率較模型組明顯增加（P＜0.05），SV-BA距離變短（P＜0.05），每搏輸出量、心輸出量均有效提高（P＜0.05）。見表2。

4 討論

斑馬魚（zebrafish），個(gè)體長約3～4 cm，具有繁殖速度快，喂養(yǎng)簡單，容易大規(guī)模飼養(yǎng)的特點(diǎn)。斑馬魚作為新型模式動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)正在逐漸被人們認(rèn)識(shí)，其基因與人類基因的相似度達(dá)87%[5]。近年來斑馬魚模型已廣泛用于中藥毒性成分、有效物質(zhì)篩選及藥物代謝研究[6]。斑馬魚早期胚胎透明，發(fā)育24 h時(shí)即可出現(xiàn)心跳，發(fā)育48 h時(shí)心臟已形成并具有完整功能，借助顯微鏡可以方便觀察藥物對(duì)心臟的毒性作用。

桔梗味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，具有宣肺、祛痰、利咽、排膿的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，桔?！爸餍孛{痛如刀刺，腹?jié)M腸鳴幽幽，驚恐悸氣”[7]?，F(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)，桔梗及其有效活性物質(zhì)具有心臟保護(hù)[8]、抗腫瘤[9-10]、抗炎[11]、預(yù)防缺血再灌注損傷的功效[12]。YU等[13]發(fā)現(xiàn)桔梗內(nèi)活性成分木犀草素具有預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的作用，其機(jī)制可能與降低心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，減少活性氧生成，抑制線粒體凋亡信號(hào)通路激活途徑有關(guān)。LIN等[14]研究表明，桔梗提取物可通過抑制IGF-IIR表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

表1 不同濃度阿霉素干預(yù)后斑馬魚心臟功能比較（x-±s）

圖3 各組斑馬魚心包及心臟表型比較

表2 各組斑馬魚心臟功能比較（x-±s）

本研究選用心臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因（cmlc2：EGFP）斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過觀察斑馬魚心臟表型，測(cè)量SV-BA距離，計(jì)算心率、每搏輸出量、心輸出量等心臟指標(biāo)進(jìn)行整體毒性評(píng)估。靜脈竇和動(dòng)脈球之間的距離可反映心房和心室的位置變化。我們發(fā)現(xiàn)10、20 μmol/L阿霉素誘導(dǎo)24 h后，斑馬魚活動(dòng)能力受限，SV-BA距離增大，心房、心室較正常組明顯變大，出現(xiàn)不同程度的心包水腫，心率出現(xiàn)下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，10 μmol/L阿霉素能夠建立斑馬魚心臟損傷模型。每搏輸出量及心輸出量是衡量心臟功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，心輸出量的降低是心力衰竭的重要臨床指征[15]。本研究結(jié)果表明，40、80 μg/mL桔梗提取物干預(yù)24 h后，心臟損傷模型斑馬魚心包水腫消失，每搏輸出量及心輸出量均有所提高，心功能得到顯著改善，阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷得到了抑制。

綜上所述，桔梗提取物在保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的斑馬魚心臟損傷方面有一定的效果，但其具體分子機(jī)制以及信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。