譚好臣，王瑗媛，李書印，張 琪，劉國祥，劉本文

(1:濰坊市峽山水庫管理局，濰坊 261325) (2:中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

角藻屬(CeratiumSchrank)隸屬甲藻門(Dinoflagellates)、甲藻綱(Dinophyceae)、膝溝藻目(Gonyaulacales)、角藻科(Ceratiaceae)，為真性浮游物種，廣泛分布于海洋和陸表水域. 該屬已描述的海洋、淡水種、亞種、變種和變型已達到225個，其中僅有13個是有效的命名[1]，目前僅包含4個淡水種[1-2]，常見的為飛燕角藻(Ceratiumhirundinella)和擬二叉角藻(C.furcoides). 該屬種類通常為單細胞，有時連接為群體. 細胞通常不對稱，強烈背腹扁平. 上殼通常具有一個稍向右側(cè)傾斜的大頂角. 在下殼處常有2～3個底角. 橫溝位于中央平面，環(huán)狀或略呈螺旋狀. 縱溝沒有延伸至上殼. 板片格式為4′(3′), 0a (1a), 6′′, 5-6c, 6′′′, 2′′′′[3].

甲藻是海洋和淡水中重要的浮游生物類群，是形成赤潮和水華的主要類群之一[4]. 淡水甲藻水華多是由多甲藻屬(Peridinium)[5-6]和擬多甲藻(Peridiniopsis)種類引起的[7-9]，由角藻屬種類引起的水華少見報道. 然而近年來，角藻屬種類擬二叉角藻在世界各地陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，在巴西出現(xiàn)尤為頻繁，且多在富營養(yǎng)化的水庫、魚塘等水體形成水華[10-18]. 據(jù)多篇文獻報道，擬二叉角藻具有較高的生長速率、較大的粒徑、高效的資源利用能力以及特殊的生活史策略，可抵抗浮游動物的攝食，表現(xiàn)出較強的入侵能力，有不斷擴張的趨勢[19-23].

迄今為止，該種在中國還未見報道，有關(guān)其在國內(nèi)的分布以及系統(tǒng)發(fā)育位置尚不清楚. 本研究從中國多個淡水生境中采集到角藻屬種類樣本，并鑒定為擬二叉角藻. 該種在國外報道較多，但在中國屬首次報道，為中國新紀錄種. 本研究的主要目的是對該種進行詳細的形態(tài)學(xué)描述并對其系統(tǒng)發(fā)育位置加以確定，以及結(jié)合該種的分布特征揭示其可能存在的生態(tài)風(fēng)險.

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

本研究樣本采自中國的多個省市：山東省濰坊市、湖北省仙桃市、四川省成都市、吉林省輝南縣.

定性樣品采用25#浮游生物網(wǎng)撈取，所獲野外新鮮樣品一部分加入10%的甘油福爾馬林固定保存于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻類標本庫中，標本標號見形態(tài)學(xué)觀察部分. 另一部分靜置于采樣瓶中加入乙醇沉淀數(shù)分鐘，吸取沉淀保存于90%乙醇中. 具體采集方法參考章宗涉等的方法[24].

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)學(xué)鑒定參考Taylor依據(jù)板片格式類型建立的甲藻分類系統(tǒng)[25]. 藻體的顯微圖像采用Olympus BX53光學(xué)顯微鏡獲取，使用微分干涉(differential interference contrast, DIC)、明場(bringt field, BF)以及熒光(epifluorescence microscopy, EFM)模式進行觀察. 為了觀察板片，福爾馬林固定的細胞先用0.1% Fluorescent Brightener 28(Sigma，UK)(紫外激發(fā)光為460～490 nm，發(fā)射光為520 nm)染色30 min[26].

1.3 單細胞DNA提取

由于甲藻難以培養(yǎng)，本研究參照Ki等[27]基于環(huán)境樣品的單細胞PCR方法，稍加改進后提取樣本的基因組，具體步驟為：吸取約20 μL樣品保存液置于凹玻片上，再加入200 μL的無菌雙蒸水. 在倒置顯微鏡(Olympus CKX41, Japan)下用拉細的毛細管挑取少數(shù)細胞，轉(zhuǎn)移至滴有無菌雙蒸水水滴的凹玻片上. 如此兩三次，以清除乙醇和其他雜質(zhì). 最后將細胞轉(zhuǎn)移至200 μL PCR管中，加入10 μL礦物油后離心，置于-20℃下保存?zhèn)溆? 向已挑取細胞的PCR管加入2 μL 200 μg/mL的蛋白酶K，離心后55℃溫育1 h，95℃下5 min滅活蛋白酶K. 樣品置于-20℃下保存?zhèn)溆?

1.4 PCR擴增與產(chǎn)物純化

用于PCR擴增18S rDNA基因的引物為：4616f, 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′；4618r, 5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′[28]. 50 μL的反應(yīng)體系為：5 μL DNA模板，10×緩沖液5 μL，2 mmol/L的dNTP 5 μL，20 μmol/L的引物各1 μL，Taq酶(TaKaRa ExTaq)1.25U，最后以滅菌雙蒸水補足至終體積. PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min 40 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min. 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用平頭鑷子(使用前煮沸 10 min 處理)在紫外透射臺(CUV30A, 上海勤翔)上切割目的條帶，用Axygene凝膠回收試劑盒純化回收純化PCR產(chǎn)物. 將PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa)載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，以通用引物(M13)為測序引物送至擎科生物科技有限公司測序.

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載擬二叉角藻的近緣18S rDNA序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析. 詳細的序列信息見表1，本研究的擬二叉角藻序列信息及登錄號用灰色標記.

表1 本研究采用的物種名稱及其GenBank登錄號

序列矩陣采用Mafft7.2[29]進行比對，經(jīng)MEGA6.0[30]手工剪切校正后再使用MEGA6.0[30]進行堿基組成分析、堿基轉(zhuǎn)換與顛換的比率分析，采用DAMBE[31]軟件進行核苷酸替代飽和分析以判斷數(shù)據(jù)集是否適合條件進行下一步的系統(tǒng)發(fā)育分析. 矩陣的最佳核苷酸替代模型采用IQ-TREE 1.6.10[32]內(nèi)置的ModelFinder軟件進行評估. 采用最大似然法(ML)和貝葉斯算法(BI)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹. ML樹和貝葉斯樹分別采用IQ-TREE 1.6.10[32]軟件和MrBayes3.1.2[33]軟件. 貝葉斯分析運行2000000代，取樣頻率為1000，分析達到平穩(wěn)(標準誤差<0.01)則運行結(jié)束，舍棄前25%的老化樣本后對各進化樹進行總結(jié). 進化樹的查看和編輯采用Figtree 1.4.2 (http://tree.bio.ed. ac.uk/software/figtree/).

1.6 浮游藻類生物量和理化參數(shù)測定

計數(shù)使用浮游生物計數(shù)框. 計數(shù)方法采用行格法，每個樣品計數(shù)2次，每次結(jié)果與兩次計數(shù)平均值之差不大于±15%. 擬二叉甲藻生物量(鮮重)估算時，每個種類測量30個細胞的大小，取平均值依據(jù)相應(yīng)的幾何體積公式計算體積[24, 34]. 理化參數(shù)和葉綠素a濃度的測定方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[35].

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

擬二叉角藻

Ceratiumfurcoides(Levander) Langhans 1925,ArchivfürProtislenkunde52: 585-602.

Ceratiumhirundinellavar.furcoidesLevander 1894, Acta Soc. Fauna Flora Fenn. 12, Nr. 2, 1-115, T. 1-3.

常見于營養(yǎng)豐富流動性較差的水體中，大量繁殖致使水體呈現(xiàn)黃褐色(圖1A). 細胞為窄紡錘形，背腹強烈扁平，葉綠體多數(shù)，周生盤狀，黃色至褐色，上殼漸尖形成一個大的頂角. 下殼寬、短，具有2(-3)個底角(圖1B,C). 橫溝輕微螺旋，縱溝不延伸至上殼、較寬(圖1B,C). 板片表面具有窩孔紋(圖1F). 細胞大?。?22～268 μm×32～56 μm.

板片形狀和排列：板片格式為3′, 1a, 6′′, 6c, 6′′′, 2′′′′(圖1C, D, E). 頂板3塊，向上逐漸變窄延伸至頂孔. 前間插板1a短、三角形，沒有延伸至頂孔位置. 溝前板6塊，四邊形或五邊形. 橫溝板6塊. 縱溝板若干塊，脆弱容易脫落. 溝后板6塊，板片1′′′和2′′′通常形成一根頂角，板片4′′′和5′′′形成另一根底角. 兩塊底板較大，通常形成一根較大的中-底角(圖1C, D, E). 板片具有半保留的復(fù)制方式，細胞分裂時，兩個子細胞各得到母細胞板片的一半(圖1F, G).

國內(nèi)分布：山東省濰坊市，2018年9月13日采集于峽山水庫(標本號SD2018050/051(HBI)). 湖北省仙桃市，2008年3月30日，張琪采集于一小水坑(標本號：HB200802a (HBI)；四川省成都市，2010年10月26日，張琪采集于西南財經(jīng)大學(xué)內(nèi)一水池(標本號SC201001 (HBI)). 吉林省輝南縣，2006年8月6日，劉國祥采集于小龍灣.

圖1 擬二叉角藻：(A)示生境；(B)單個細胞，示細胞形態(tài)；(C)細胞外觀手繪圖，示左、右兩側(cè)板片排列. (D、E)細胞外觀熒光顯微圖，分別示左、右兩側(cè)板片排列；(F、G)細胞外觀熒光顯微圖，分別示上、下殼的半保留復(fù)制(A=50 cm; B=20 μm; D、E、F、G=10 μm. 符號說明：X′, 頂板; X′′, 溝前板; X′′′, 溝后板, X′′′′, 底板; cX, 橫溝板; Xa, 間插板; XS，縱溝板；X為序號)Fig.1 Ceratium furcoides：(A) Ecological habitat；(B) Single cell, showing the cell shape； (C) The hand-drawing of the cell, showing left and right sides view of plate pattern respectively；(D，E) The epifluorescence of the cell, showing left and right sides view of plate pattern respectively； (F，G) The epifluorescence of the cell, showing semiconservative replication of the up and down plate respectively (Scale bars: A=50 cm; B=20 μm; D, E, F, G=10 μm. The legend of symbols: X′, apical plates; X′′, precingular plates; X′′′, postcingular plates； X′′′′, antapical plates; cX, cingular plates; Xa, intercalary plates; XS, sulcal plate; X is serial number)

2.2 序列矩陣分析

該數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)比對、校正、剪切后，產(chǎn)生一個含有28條序列，長度為1648bp的基因序列矩陣，其中保守位點1089個，變異位點559個，簡約信息位點392個，單態(tài)位點167個；矩陣中4種堿基(A、T、C和G)的平均含量分別為25.73%、28.00%、19.70%和26.57%. GC含量(46.27%)低于AT含量(53.73%). ModelFinder分析結(jié)果表明，該矩陣的最佳模型為GTR+F+R3. 飽和指數(shù)分析(Iss=0.1074 < Iss.c=0.7816)顯示序列矩陣并未飽和，可用于系統(tǒng)發(fā)育分析.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于18S rDNA構(gòu)建的膝溝藻目的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)和最大似然樹(圖3)在拓撲結(jié)構(gòu)有所差異，但均顯示膝溝藻目為很好的單系類群，最大似然自展支持值和貝葉斯后驗概率分別為98/1.00，角藻科形成兩大獨立的分支，分別代表新角藻屬(Neoceratium)(海洋種類)和角藻屬(淡水種類)類群，最大似然自展支持值和貝葉斯后驗概率分別為99/1.00，本研究的兩株擬二叉角藻位于角藻科的角藻屬中，與飛燕角藻具有最近的親緣關(guān)系，最大似然自展支持值和貝葉斯后驗概率分別為100/1.00. 多甲藻屬(Peridinium)和擬多甲藻屬(Peridiniopsis)均為多系.

圖2 基于18S rDNA構(gòu)建的膝溝藻目的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(節(jié)點處顯示高于0.5的貝葉斯后驗概率. 本研究新加入的序列用灰色標記)Fig.2 Bayesian phylogenetic tree of the order Gonyaulacales constructed by the 18S rDNA sequences (The numbers on the nodes represent the posterior probabilities above 0.50. The newly added sequences in this study were shaded in grey)

圖3 基于18S rDNA構(gòu)建的膝溝藻目的最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(節(jié)點處顯示高于50的最大似然自展支持值. 本研究新加入的序列用灰色標記)Fig.3 ML phylogenetic tree of the order Gonyaulacales constructed by the 18S rDNA sequences (The numbers on the nodes represent the bootstrap support values above 50. The newly added sequences in this study were shaded in grey)

2.4 浮游藻類組成及理化參數(shù)

本次采樣共監(jiān)測到峽山水庫B位點的浮游藻類41屬69種，分屬7門，其中藍藻門10屬18種，綠藻門21屬30種，硅藻門3屬13種，隱藻門1屬2種，金藻門1屬1種，甲藻門3屬3種，裸藻門2屬2種. 各種類細胞密度變化范圍為0.03×106～30.45×106cells/L，生物量變化范圍為0.01～86.31 mg/L. 擬二叉角藻在該位點的密度達1.23×106cells/L，生物量最高值為86.31 mg/L. 各門類藻類細胞密度及生物量所占比例見圖4. 此外，該點具有最高的葉綠素a濃度，達125.77 μg/L，氨氮濃度為0.426 mg/L，總氮濃度為4.10 mg/L，總磷濃度為0.05 mg/L，水溫為28℃，透明度為0.3 m，電導(dǎo)率為847 μS/cm，pH為 7.9，溶解氧濃度為8.8 mg/L，化學(xué)需氧量為14.9 mg/L.

圖4 峽山水庫B位點浮游藻類種類密度(a)和生物量(b)組成Fig.4 Density (a) and biomass (b) composition of phytoplankton species at site B in Xiashan Reservoir

3 討論

廣義角藻屬包括淡水和海洋種類，僅有極少數(shù)種類發(fā)現(xiàn)于淡水[2]. 借助光學(xué)和電子顯微鏡對淡水和海洋角藻的板片結(jié)構(gòu)進行細致研究后發(fā)現(xiàn)，廣義角藻屬板片格式為 4′, 6′′, 5-6c, 6′′′, 2′′′′，再加上2塊或更多塊縱溝板片[36]. 海洋角藻種類具有5塊橫溝板而淡水種類具有6塊橫溝板[37].

本研究的樣本在生境和形態(tài)學(xué)特征上均與Langhans[38]和Levander[39]描述的飛燕角藻二叉變種(C.hirundinellavar.furcoides)極其相似. Langhans[38]建議將飛燕角藻二叉變種提升到種的地位. 飛燕角藻是全球分布的常見種，該物種顯示出相當大的形態(tài)差異，因而許多學(xué)者常劃分出許多變型或變種. 基于種群的研究分析，擬二叉角藻與飛燕角藻非常相似，其最大的區(qū)別在于前者僅有3塊頂板延伸至頂端，第4塊板片沒有延伸至頂端成為1塊間插板，板片格式為3′, 1a, 6′′, 6c, 6′′′, 2′′′′，而后者具有4塊延伸至頂部的頂板，板片格式為4′, 6′′, 6c, 6′′′, 2′′′′[40]. 基于形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，本研究將采集的角藻屬樣本鑒定為擬二叉角藻. 該種在國內(nèi)屬首次報道，為中國新紀錄種. 該種為世界性廣布種類，文獻記載常生活于許多寡-中營養(yǎng)的小型水體中[2]. 我國發(fā)現(xiàn)的生境多為中富營養(yǎng)化甚至富營養(yǎng)化的水體，而且均在水溫較高的夏、秋季節(jié)，與常見的飛燕角藻多見于冬、春低溫季節(jié)不同. 事實上國外文獻也多報道擬二叉角藻更偏向生活在水溫較高的季節(jié)[41].

基于18S rDNA構(gòu)建的膝溝藻目的貝葉斯樹和最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹顯示海洋和淡水角藻種類分別聚在單獨的分支中，強烈支持將海洋和淡水角藻種類分成兩個不同類群. Logares等認為海洋和淡水種類通常沒有緊密的親緣關(guān)系，且多數(shù)海洋淡水轉(zhuǎn)變似乎都不是最近發(fā)生的[28]. 基于橫溝板數(shù)目的差異，Gómez等建議將海洋角藻屬種類置于單獨的新屬——新角藻屬中且認為橫溝板數(shù)目是區(qū)分新角藻屬和狹義角藻屬最顯著的形態(tài)特征[3]. 系統(tǒng)發(fā)育研究進一步確認了擬二叉角藻的系統(tǒng)位置，即擬二叉角藻位于膝溝藻目角藻科的角藻屬中，與飛燕角藻具有最近的關(guān)系. 基于18S rDNA構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹和最大似然樹盡管在拓撲結(jié)構(gòu)有所差異，這是由于多甲藻屬、擬多甲藻屬多系性的存在以及甲藻類群有限的分子數(shù)據(jù)導(dǎo)致的，但在膝溝藻目以及目以下水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上是穩(wěn)定且高度一致的.

根據(jù)中國環(huán)境檢測總站2018年發(fā)布的全國地表水水質(zhì)監(jiān)測報告顯示(http://www.cnemc.cn/jcbg/qgdbsszyb/)，峽山水庫局部時段為Ⅴ類水質(zhì)，呈現(xiàn)中富營養(yǎng)化狀態(tài). 而峽山水庫管理局2019年6月的監(jiān)測數(shù)據(jù)(理化參數(shù)、葉綠素a濃度、藻細胞密度及生物量)顯示該水庫的水華位點在本次采樣中呈現(xiàn)出明顯的富營養(yǎng)化狀態(tài). 盡管在細胞密度上尖頭藻和浮絲藻等一些絲狀藍藻占主要優(yōu)勢，但因擬二叉角藻個體細胞體積較大，在生物量上占絕對優(yōu)勢. 本研究還在中國的東北、華中、西南地區(qū)等多個不同程度富營養(yǎng)化位點均采集到擬二叉角藻，說明其分布范圍較廣，偏好于溫度較高的季節(jié)、流動性較差的富營養(yǎng)化水體，暴發(fā)面積較水華藍藻小，通常只在水體局部位置形成. 這與國外文獻報道的擬二叉角藻更偏向生活在較高水溫季節(jié)的結(jié)論一致[41]. 擬二叉角藻與眾多水華藍藻一樣偏好于高溫的富營養(yǎng)化水體，該位點的藻類物種組成也證實了這一點，但不同的是，前者偏好于吸收藍光[41]，而常見的水華藍藻如微囊藻(Microcystis)能利用更多的綠光和黃光[42]. 之前的文獻報道擬二叉角藻常生活于寡-中營養(yǎng)的小型水體中[2]，進一步研究顯示擬二叉角藻擴大了其分布范圍. 鑒于擬二叉角藻具較高的生長速率、較大的粒徑抵抗浮游動物的攝食以及高效的資源利用能力、特殊的生活史策略和極強的擴張能力[19-23,43-45]，加之國內(nèi)眾多淺水湖泊、水庫呈現(xiàn)不同程度的富營養(yǎng)化狀態(tài)，未來擬二叉角藻極有可能持續(xù)擴張在不同水體中出現(xiàn)甚至形成水華，應(yīng)給予高度關(guān)注. 本研究給出了詳細的形態(tài)學(xué)特征和分子特征序列，有助于將來對該物種開展進一步深入研究.