陶政宇，付剛，聞建平，張大偉，3

（1天津大學化工學院，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津300072；2中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3中國科學院大學，北京100049）

肌酐是人體代謝的產(chǎn)物，可隨尿液排出到體外。當腎臟代謝功能紊亂，肌酐會于體內(nèi)積聚，進而造成慢性腎衰竭[1-2]。對于檢測和治療，目前研究多是從肌酐酶著手，利用肌酐酶聯(lián)體系進行體內(nèi)肌酐含量的測定，又或是通過構(gòu)建低毒菌株來分解體內(nèi)代謝多余肌酐[3]。肌酐酶的市場需求量大，但由于野生菌株產(chǎn)量低、工業(yè)放大困難[4-5]，使肌酐酶的生產(chǎn)成本高，同時Tang等[6]雖然實現(xiàn)重組大腸桿菌肌酐酶菌株的構(gòu)建，但其比酶活力不高，并且純化蛋白的方法過于復雜而導致胞內(nèi)蛋白的回收率過低無法進行市場應用。因此構(gòu)建一株能夠胞外生產(chǎn)肌酐酶的重組基因工程菌株，既可方便工業(yè)生產(chǎn)和純化肌酐酶，又可以該菌為基礎，進而構(gòu)建能夠幫助治療腎衰竭患者的無毒或低毒的重組菌株。

枯草芽孢桿菌是常見的蛋白表達宿主菌株，與大腸桿菌相比，其具有優(yōu)異的胞外分泌能力，可通過Sec、Tat 經(jīng)典分泌途徑、Holin 孔蛋白以及細胞泄漏等方式將細胞內(nèi)的蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中[7-8]。目前已有很多的研究報道使用枯草芽孢桿菌作為高效生產(chǎn)的工程菌株，Chen等[9]通過啟動子篩選成功使α-淀粉酶的表達量提高2倍，Li等[10]通過啟動子優(yōu)化和分子伴侶的應用成功將生長因子FGF21在枯草芽孢桿菌中可溶表達，此外利用細胞泄漏的方式成功在枯草芽孢桿菌中生產(chǎn)尿苷[11]、核黃素[12]?？莶菅挎邨U菌是國際公認的安全菌株，在培養(yǎng)過程中，未有內(nèi)毒素的產(chǎn)生，在很大程度上減輕了工業(yè)發(fā)酵應用的額外負擔。同時，作為常用宿主菌株，枯草芽孢桿菌具有良好的發(fā)酵工藝技術(shù)，這為目的產(chǎn)物進一步擴大生產(chǎn)提供了基礎。本研究成功構(gòu)建了一株基于泄漏表達的產(chǎn)肌酐酶枯草芽孢桿菌菌株，該菌株即可作為潛在的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)應用菌株，又可根據(jù)工程菌株自身無毒的特性，進一步構(gòu)建治療腎衰竭患者的無毒重組菌株，具有良好的應用潛力和研究價值，同時據(jù)本文作者了解這是首次關(guān)于肌酐酶在枯草芽孢桿菌表達的研究，為構(gòu)建枯草芽孢桿菌細胞工廠提供進一步的理論基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種、質(zhì)粒和引物

菌種、質(zhì)粒及構(gòu)建引物分別列于表1、表2 和表3，引物用Primer5 軟件進行設計，送蘇州金唯智生物科技有限公司合成，實驗中所有菌株均在37℃，220r/min條件下培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

2×Primer STAR Mix DNA 聚合酶購自Takara 公司；一步克隆試劑盒（ClonExpress?Ⅱ）、2×Taq PCR Master Mix和Marker Ⅲ購自于南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑Cocktail、麥芽糖、彩虹廣譜蛋白Maker、考馬斯亮藍R250 和肌酐均購自北京索萊寶生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-03）購自北京天根生化科技有限公司；柱式PCR 膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，D2500-02） 購自OMEGA公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證

以NCBI 中惡臭假單胞桿菌來源的Creatininase（WP_120653449.1）的基因序列為模板，送往金唯智生物科技有限公司進行全基因合成和密碼子優(yōu)化。以合成的Cre 基因序列為模板，利用引物Creatininase-F 和Creatininase-R 對目的基因Cre 進行擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，驗證后的PCR產(chǎn)物進行膠回收。pMA5表達載體同樣使用該手段擴增后利用膠回收試劑盒純化回收，將目的片段Cre 與載體pMA5 通過一步克隆試劑盒進行拼接，拼接步驟嚴格按照說明書進行。連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli 商業(yè)化感受態(tài)DH5α 中，用含有100μg/mL氨芐西林（Amp）的LB平板進行陽性克隆篩選，進而完成重組質(zhì)粒pMA5-CR的構(gòu)建。同樣重組表達質(zhì)粒pMGC也依據(jù)此方法進行構(gòu)建。

表1 實驗菌種

表2 實驗中所用質(zhì)粒

1.2.2 重組表達菌株的構(gòu)建

將測序結(jié)果正確的表達質(zhì)粒通過Spizizen 鹽化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入表達宿主B.subtilis 1A751中，通過菌落PCR 驗證篩選正確的重組菌株，重組菌株1A751H、1AHC和1AGC均按照文獻中所述方法進行構(gòu)建[13]。

1.2.3 基因敲除菌株的構(gòu)建

通過單敲換手段，將Holin 途徑的編碼基因pbsx 和bhlAB 用氯霉素抗性基因（Cmrgene）進行代替。以菌株ΔPbsX 為例，構(gòu)建敲除菌株的步驟如下。

①以實驗室保存的Cmrgene為模板，通過引物PbsX-1-F 和PbsX-1-R 進行擴增，通過膠回收試劑盒進行目的產(chǎn)物純化回收，獲得片段1。

②在pbsx 基因上游區(qū)段截取約為1500 bp，至pbsx 基因的5’端為止。通過引物PbsX-2-F 和PbsX-2-R 進行擴增，隨后利用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物純化回收，獲得片段2。

③通過引物PbsX-3-F 和PbsX-3-R 對pbsx 基因的下游區(qū)段進行擴增，約為1500bp（從3’端開始），利用膠回收試劑盒進行回收，獲得片段3。

④通過PCR 擴增，利用引物PbsX-2-F 和引物PbsX-3-R 將片段1、2、3 融合，獲得PCR 產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)入B.subtilis1A751感受態(tài)中，涂布在氯霉素濃度為12.5μg/mL的固體LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。

⑤挑取單菌落，使用引物PbsX-CR-R和CR-F進行菌落PCR 驗證，驗證正確的菌株，此為基因敲除株ΔPbsX。

表3 本研究所用引物

另外，通過Spizizen 轉(zhuǎn)化，將表達質(zhì)粒pMGC轉(zhuǎn)入菌株ΔPbsX，涂布在12.5 μg/mL 氯霉素和50 μg/mL 卡那霉素的固體平板上，過夜培養(yǎng)后進行PCR菌落驗證，即可獲得過表達肌酐酶的基因敲除重組菌株ΔPbsX-GC。

按上述同樣的方法獲得ΔBhlAB-GC菌株。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達和SDS-PAGE分析

所有轉(zhuǎn)入表達質(zhì)粒pMGC的重組菌株均在零時誘導，誘導物麥芽糖在搖瓶中的終濃度為質(zhì)量分數(shù)3%。搖瓶培養(yǎng)及SDS-PAGE 蛋白樣品制作步驟，根據(jù)參考文獻進行操作[13]。1.2.5 肌酐酶的酶活測定用聯(lián)乙酰與α-萘酚反應測定肌酸，依據(jù)原理為底物肌酐在肌酐酶作用下水解生成肌酸，碳酸鈉溶液終止反應[14]。在弱堿性條件下，α-萘酚被雙乙酰氧化為α-萘醌，α-萘醌與肌酸反應生成熒光化合物，可在525nm波長下進行吸光值測定。檢測中所用試劑如下：0.3mol/L磷酸鉀緩沖溶液，pH 6.5；0.1mol/L肌酐溶液；4%Na2CO3溶液；2%α-萘酚溶液；1.2g NaOH 和3.2g Na2CO3溶于100mL 雙蒸水；0.05%二乙酰溶液。用酶稀釋液替代酶液，其他步驟相同，所得溶液吸光度為空白吸光度（ΔAb），ΔA= ΔAε- ΔAb。在上述條件下，單位酶活力定義為：每分鐘催化生成1μmol肌酸所需的酶量，計算公式見式(1)和式(2)。

式中，1.0 為反應液總體積，mL；0.1 為酶液體積，mL；10 為反應時間，min；df 為稀釋倍數(shù)；C 為酶濃度，mg/mL；0.0704 為生色基團在525nm處的摩爾吸光系數(shù)，cm2/μmol。

1.2.6 肌酐酶最適反應pH和溫度的確定

最適溫度的確定：將酶活力測定體系置于不同的反應溫度，溫度范圍30～70℃，其反應體系pH為6.5，比較各溫度下的肌酐酶活力，得到最適作用溫度。觀測肌酐酶的熱穩(wěn)定性，將酶在溫度范圍從30～70℃的環(huán)境下處理15min，在最適溫度下進行酶活力測定，殘留酶活用于評估溫度對肌酸酶穩(wěn)定性的影響。

最適pH 的確定：分別在pH=3.0～11.0 的范圍內(nèi)，在不同pH 單位的磷酸鉀緩沖鹽溶液中測定酶活力，以確定最適反應pH。觀測酶的pH穩(wěn)定性是將酶液分別存放在不同pH 的緩沖溶液中，常溫保存24h，隨后在最適pH 下測定酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定范圍。

1.2.7 胞外重組蛋白純化和Native-PAGE分析

取25mL培養(yǎng)菌液，在4℃、6750g下離心15min，收集離心后的胞外上清液。取1mL Ni-NTA 填料于柱子中，用10 倍柱體積的H2O 和清洗液先后清洗柱子，增強填料的蛋白結(jié)合力。隨后將胞外上清液裝于50mL離心管內(nèi)，加入填料，冰上結(jié)合2～3h。結(jié)合后用清洗液除去雜蛋白，最后加入洗脫液（elution buffer）洗脫目的蛋白，純化結(jié)果通過12%SDS-PAGE 鑒定，重組回收后的目的蛋白使用Bardford法[15]測定蛋白濃度。

Native-PAGE 分析可用于鑒定酶的活性功能結(jié)構(gòu)，其凝膠配制成分與SDS-PAGE類似。所用活性2×樣品液（sample buffer）組成為62.5mmol/L Tris緩沖液、25%甘油和1%溴酚藍，所用電泳液（running buffer）由25mmol/L Tris和192mmol/L甘氨酸組成。其電泳條件為冰上處理，電壓在100～200V之間。

1.2.8 Calcein-AM/PI染色方法

Calcein-AM 是一種只針對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm，Em=515nm）。碘化丙啶PI 是死細胞熒光探針，無法穿過活細胞膜，僅可對死細胞著紅色熒光（Ex=535nm，Em=617nm）。二者同時對細胞著色可同時進行活死細胞標記，但當細胞即呈現(xiàn)紅色熒光，又呈現(xiàn)綠色熒光就表明細胞的細胞膜出現(xiàn)破損[16]。染色步驟如下。

①使用0.01mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）配制濃度為20μmol/L Calcein-AM 溶液和45μmol/L PI 染色液，之后各取10μL加入80μL0.01mol/L磷酸緩沖溶液配制為100μL工作液。

②隨后用0.01mol/L 磷酸緩沖溶液對細胞進行稀釋使其密度為1×105～1×106細胞/mL，取出200μL細胞懸液加入100μL 染色液，混勻，37℃孵育15min。

③在熒光顯微鏡下進行觀察，將觀察的圖像進行重合得到實驗結(jié)果。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達及酶學性質(zhì)分析

2.1.1 啟動子優(yōu)化及重組蛋白的誘導表達結(jié)果分析啟動子強度的不同，可以影響目的基因的轉(zhuǎn)錄程度，進而影響外源蛋白在宿主菌株中的表達水平。為得到肌酐酶在枯草芽孢桿菌中合適的轉(zhuǎn)錄水平，通過組內(nèi)已有的蛋白研究，選用麥芽糖誘導型啟動子Pglv來代替pMA5的組成型啟動子PHpaⅡ

[17]，從而構(gòu)建了麥芽糖誘導型表達質(zhì)粒pMGC。同時依靠組成型啟動子PhpaⅡ的重組肌酐酶表達質(zhì)粒pMA5-CR也進行構(gòu)建。質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC的驗證結(jié)果見圖1，約在1200bp 和1500bp 處有明亮單一的條帶，與軟件預測的理論條帶大小一致。將驗證正確的菌液接種于試管中培養(yǎng)12～14h，提取質(zhì)粒，送往金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果用SnapGene 軟件進行分析比對，進而獲得帶有肌酐酶目的基因的重組表達質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC。

圖1 重組質(zhì)粒pMA5-CR和pMGC的菌落驗證

將質(zhì)粒pMA5-CR、pMGC 和pMA5 轉(zhuǎn)入B.subtilis 1A751進而構(gòu)建表達菌株1AHC、1AGC和對照菌株1A751H，搖瓶培養(yǎng)后的SDS-PAGE 分析結(jié)果見圖2。通過SnapGene軟件分析預測肌酐酶的理論蛋白分子量為30000，圖2 中，可明顯觀測到菌株1AGC 與1AHC 在30000 處存在條帶，與理論預測的蛋白分子量大小一致，同時可明顯觀察到麥芽糖誘導型菌株1AGC的表達量明顯高于組成型啟動子表達菌株1AHC。此外，從圖2(a)的搖瓶培養(yǎng)結(jié)果可分析出在24h時肌酐酶主要以胞內(nèi)可溶的形式存在逐步積累在細胞內(nèi)部。而從圖2(b)的結(jié)果來看，隨培養(yǎng)時間增加到48h時，胞外肌酐酶的蛋白量逐漸增加，胞內(nèi)可溶組分減少，這表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中不依賴于信號肽即可分泌到胞外培養(yǎng)基中。在通過啟動子優(yōu)化提高蛋白表達量的同時，出現(xiàn)少量錯誤折疊的蛋白即包涵體，很大程度是由于部分蛋白折疊中間體錯誤聚集形成的，在后續(xù)的實驗中可以考慮調(diào)節(jié)啟動子強度、降低培養(yǎng)溫度等手段進行調(diào)節(jié)。

2.1.2 胞外肌酐酶的酶學性質(zhì)分析

圖2 重組菌株SDS-PAGE分析

圖3 胞外肌酐酶的純化結(jié)果分析和Native-PAGE活性功能結(jié)構(gòu)分析

圖4 肌酐酶的最適反應條件和穩(wěn)定性研究

將肌酐酶重組菌株1AGC的胞外肌酐酶進行純化分析，所得純化結(jié)果見圖3(a)，圖中洗脫下的目的蛋白濃度為1.08mg/mL，并測得酶活力為257.04U/mL，比酶活為238U/mg。圖3(b)為Native-PAGE分析結(jié)果，表明胞外肌酐酶的活性功能結(jié)構(gòu)為多聚體，根據(jù)理論單體蛋白分子量為30000，進一步推測其為同源四聚體。同時根據(jù)圖4(a)可得出肌酐酶的最適反應pH和溫度分別為8.0和55℃，從圖4(b)的折線圖可分析出肌酐酶在50℃以下可較好維持活性結(jié)構(gòu)，在pH=6.0～8.0 間維持其功能結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。圖5 表明在最適反應溫度和pH 下，通過雙倒數(shù)作圖法測得肌酐酶酶促動力學參數(shù)Km為99.38mmol/L，最大反應速 率Vmax為5.9×10-2mmol/(L?s)。進而求得每秒鐘每個酶分子催化的底物分子數(shù)Kcat為655.6s-1，同時求得特異性常數(shù)Kcat/Km為6.597L/(s?mmol)。使用Brenda獲取來源于惡臭假單胞桿菌的肌酐酶的酶促動力學參數(shù)Km范圍在26～350mmol/L，而酶的催化效率Kcat/Km的數(shù)值范圍在0.008～17.4L/(s?mmol)，通過比較分析得出，在枯草芽孢桿菌中表達的重組肌酐酶的底物親和性中等，催化效率較好。將所有數(shù)據(jù)酶參數(shù)綜合分析可得出，該重組肌酐酶具有一定的市場應用潛力。

圖5 肌酐酶的雙倒數(shù)曲線

2.1.3 分子伴侶過表達菌株的SDS-PAGE分析

利用pDL整合型質(zhì)粒，將分子伴侶基因danK、groESL 和prsA 整合到枯草芽孢桿菌1A751 的基因組上，從而完成基因danK、groESL 和prsA 的過表達。分子伴侶的過表達可以進一步的幫助胞內(nèi)蛋白的可溶性表達[18]，因此構(gòu)建分子伴侶與肌酐酶共表達菌株1DGC、1GGC 和1PGC，將菌株進行培養(yǎng)與SDS-PAGE 分析，結(jié)果見圖6。以1AGC 菌株結(jié)果作為正對照，從胞外和可溶組分來看：枯草芽孢桿菌常用分子伴侶DnaK、GroESL和PrsA的過表達并未能有效提高肌酐酶的胞內(nèi)可溶產(chǎn)量，其蛋白表達量與對照菌株基本一致?？莶菅挎邨U菌中常用的分子伴侶應用無效很有可能是單一過表達的局限性造成的，因此后續(xù)研究中可利用多分子伴侶共表達體系來幫助肌酐酶的折疊和表達量的提升。此外，分子伴侶強度的調(diào)控同樣可能是影響因素，適中的分子伴侶表達強度可以更好地來幫助肌酐酶的正確折疊，從而完成蛋白表達量的提高。

圖6 分子伴侶重組菌株的SDS-PAGE分析

2.2 肌酐酶在枯草芽孢桿菌中分泌機制的初步探究

2.2.1 經(jīng)典分泌途徑和Holin 蛋白通道的分析與排除

對于肌酐酶在枯草芽孢桿菌中可不依賴于信號肽即可完成胞外分泌的現(xiàn)象，本文作者課題組對其分泌機制進行了初步探究。通常在枯草芽孢桿菌中，大部分的細胞質(zhì)蛋白主要通過Sec途徑從胞內(nèi)分泌到胞外培養(yǎng)基中，而小部分蛋白則從Tat 途徑分泌到細胞外。為分析肌酐酶的分泌是否與這兩個途徑相關(guān)，分別通過過表達Sec 途徑的關(guān)鍵元件SecY、SecE、SecYEG 和敲除Tat 途徑的編碼基因tatAyCy、tatAdCd 和tatAc 來進行驗證，使用實驗室保存菌種轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pMGC完成菌株構(gòu)建，進而培養(yǎng)評價分析，24h 和48h 的SDS-PAGE 結(jié)果見圖7。菌株1AGC作為對照菌株，從胞內(nèi)外的目的蛋白的表達量來看，SecY-GC、SecE-GC、SecYEG-GC 以及ΔTat-GC與對照菌株并無差別，這表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌可能不依賴于Sec 和Tat 分泌途徑。

圖7 經(jīng)典分泌途徑重組菌株的SDS-PAGE分析

Holin 蛋白途徑是一種不依賴于信號肽即可將蛋白釋放到胞外的方式，其主要作用的元件是PbsX 和BhlAB，因此通過單交換手段將氯霉素抗性基因替換這兩個關(guān)鍵元件，構(gòu)建突變菌株ΔPbsX和ΔBhlAB，隨后轉(zhuǎn)入誘導型表達質(zhì)粒pMGC，進行培養(yǎng)評價，SDS-PAGE 結(jié)果見圖8。從圖中觀察可知，與作為對照菌株的1AGC 相比，Holin 關(guān)鍵元件敲除后的突變菌株所產(chǎn)肌酐酶的胞外分泌量并未受到影響，基本與對照菌株的胞外分泌量一致，這表明肌酐酶的胞外分泌并不通過Holin蛋白途徑，對此，可初步猜測肌酐酶主要通過細胞泄漏的方式從細胞質(zhì)內(nèi)釋放到胞外培養(yǎng)基中。

2.2.2 表達菌株1AGC細胞膜完整性鑒定

若一株菌株出現(xiàn)細胞泄漏現(xiàn)象，其細胞膜必定出現(xiàn)破損。通過Calcein-AM/PI 雙染色試劑盒對表達菌株1AGC 和對照菌株1A751H 進行著色來鑒定菌株細胞膜的完整性，染色結(jié)果見圖9。以菌株1A751H作為對照菌株，從圖中可觀察到，1A751H的雙染色結(jié)果經(jīng)過圖像重疊后，紅綠熒光分明，并未觀察到熒光重疊菌株。而在表達菌株1AGC 中，紅綠熒光圖像經(jīng)重疊后可明顯觀察到黃色菌株的存在，這表明表達菌株的細胞膜出現(xiàn)破損，為細胞泄漏猜想提供了充分的證據(jù)。

2.2.3 掃描和透射電子顯微鏡觀察

圖9 菌株1A751H和1AGC的染色結(jié)果

為進一步地證實肌酐酶主要通過細胞泄漏的方式釋放到胞外，采用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）對肌酐酶表達菌株進行觀察，觀察結(jié)果見圖10。圖10(a)為TEM 觀察結(jié)果，圖中可明顯看到細胞膜和細胞壁完整的菌株呈現(xiàn)一種凝視飽滿的狀態(tài)，表現(xiàn)為灰黑色。而當細胞膜和細胞壁出現(xiàn)破損后，細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)流出，使細菌呈現(xiàn)一種空洞的狀態(tài)，表現(xiàn)為白色。從圖10(a)可清晰地看到對照菌株1A751H其大部分菌株的細胞膜和壁完整，基本不存在泄漏型的空白菌株；而表達菌株1AGC的群體細胞圖中，可明顯觀察到存在大量的泄漏型菌株，約占總體的50%。此外，圖10(b)的SEM 觀察結(jié)果也可觀測到潛在的泄漏位點的存在，菌株表面的凹陷處即為泄漏孔洞的形成處，已用白色箭頭指出。因此，綜合經(jīng)典分泌途徑與Holin蛋白通道的分析結(jié)果、細胞膜染色結(jié)果和電鏡觀察結(jié)果，可得出肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌主要是通過細胞泄漏的方式完成的。對于此種分泌方式，作者推測是由于高強度啟動子的作用使得肌酐酶大量表達進而形成一種表達壓力，加速細胞泄漏或裂解進程，從而使胞內(nèi)蛋白泄漏出去。而根據(jù)圖2可知，在表達初期肌酐酶主要是以可溶狀態(tài)積聚在細胞質(zhì)內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的增長，胞內(nèi)蛋白積累量過大形成壓力進而加速細胞裂解，使細胞膜出現(xiàn)泄漏孔洞，胞內(nèi)蛋白質(zhì)逐漸從泄漏位點逐漸流出。

圖10 肌酐酶表達菌株的電子顯微鏡觀察結(jié)果

3 結(jié)論

本文主要對枯草芽孢桿菌進行了啟動子優(yōu)化，核心蛋白元件的過表達及敲除，Calcein-AM/PI 雙染色以及電子顯微鏡觀察，構(gòu)建了肌酐酶高效表達分泌菌株并解析了肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌機制。具體結(jié)論如下。

（1）通過對肌酐酶基因的密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建肌酐酶表達菌株1AHC，實現(xiàn)肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的異源表達。

（2）對啟動子進行優(yōu)化，將質(zhì)粒pMA5上的組成型啟動子PHpaⅡ更換為麥芽糖誘導型啟動子Pglv，成功構(gòu)建肌酐酶高產(chǎn)菌株1AGC，使肌酐酶的蛋白表達量有了顯著提高，并且胞外肌酐酶的酶活可達257.04U/mL，比酶活為238U/mg，此外通過Native-PAGE 分析出胞外肌酐酶的活性功能結(jié)構(gòu)為多聚體，并用雙倒數(shù)作圖法求得肌酐酶的Km、Vmax、Kcat和Kcat/Km，綜合分析后確定該重組酶具有一定的市場應用價值。

（3）研究了不依賴于信號肽的肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌機制。通過過表達Sec途徑的核心蛋白元件SecY、SecE 和SecYEG，敲除Tat 途徑的關(guān)鍵蛋白編碼基因tatAyCy、tatAdCd 和tatAc 以及Holin 蛋白通道的關(guān)鍵元件編碼基因pbsx 和bhlAB，結(jié)果表明肌酐酶在枯草芽孢桿菌中的分泌不依賴于以上途徑。并用熒光染料Calcein-AM/PI 驗證表達菌株1AGC 的細胞膜存在不同程度的破損。最后，使用透射電鏡和掃描電鏡對細菌形態(tài)進行觀察，確定肌酐酶在枯草芽孢桿菌中通過細胞泄漏完成胞外分泌。

（4）相比于傳統(tǒng)肌酐酶的宿主菌株E.coli，本文所構(gòu)建的肌酐酶表達菌株更有助于工業(yè)生產(chǎn)提純和醫(yī)療應用，并且可嘗試通過擴大培養(yǎng)來進一步提高肌酐酶的表達產(chǎn)量；又或以菌株1AGC為基礎進而加入肌酸水解酶，從而構(gòu)建對人體無毒害作用的尿毒癥醫(yī)療應用菌株。