金衛(wèi)華，駱淑媛，丁奕丹，郭露寒，張 贇，唐紅楓，孫 茜

(1.武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212；2.武漢東湖學(xué)院 生物醫(yī)用材料創(chuàng)新研究所，湖北 武漢 430212；3.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430079)

小球藻營(yíng)養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂類和微量元素等多種生物活性物質(zhì)，具有顯著增強(qiáng)免疫、抗癌、抗病毒等作用[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥廢水處理。魚(yú)苗、蝦苗的飼料要求既能提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又能增強(qiáng)苗種的免疫抗病能力，因此，小球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域也有很高的應(yīng)用價(jià)值[3]。目前，關(guān)于小球藻快速繁殖技術(shù)的報(bào)道較多[4-10]，一般集中在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)條件下的快速繁殖技術(shù)上，未見(jiàn)在有機(jī)質(zhì)(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)培養(yǎng)條件下的快速繁殖技術(shù)研究。為此，作者選擇3種實(shí)驗(yàn)室常用的微生物培養(yǎng)有機(jī)質(zhì)(蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏)，研究其對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響，以期找到一條短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)繁大量小球藻的途徑，為探索小球藻的營(yíng)養(yǎng)利用方式提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

小球藻(Chlorellazofingensis)，武漢百意欣生物技術(shù)有限公司。蛋白胨、酵母提取物，Oxoid；牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

檸檬酸，EDTA-Na2，檸檬酸鐵銨，NaNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，CaCl2，Na2CO3，H3BO3，MnCl2·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MnO4·2H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2·6H2O，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SPX-300B-G型光照恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；i3型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；AUY120型電子天平，日本SHIMADZU公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

參照文獻(xiàn)[11]配制BG-11培養(yǎng)基。

1.3 方法

取400 mL BG-11培養(yǎng)基置于500 mL透明錐形瓶中，分別按質(zhì)量梯度(0.0 g、1.0 g、2.0 g、3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g)加入121 ℃滅菌15 min的蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏水溶液85 mL。在上述各錐形瓶中，無(wú)菌接種15 mL小球藻懸液(A680值為0.10)，用棉塞塞住瓶口，以防污染；置于光照培養(yǎng)箱中，于光照強(qiáng)度為4 500 Lux、溫度為25 ℃的條件下培養(yǎng)，每24 h取培養(yǎng)液(取培養(yǎng)液前后將錐形瓶置于25 ℃恒溫?fù)u床中150 r·min-1振蕩15 min，保證小球藻分散均勻并充分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)接觸)，測(cè)定其A680值，觀察其生長(zhǎng)情況。以未接種小球藻懸液的培養(yǎng)液(但含相應(yīng)濃度的有機(jī)質(zhì))為空白對(duì)照，培養(yǎng)液起始A680值均為0。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻在以蛋白胨為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖1)

從圖1可以看出，以蛋白胨為培養(yǎng)基有機(jī)質(zhì)時(shí)，隨著蛋白胨用量的增加，小球藻的生長(zhǎng)速度逐漸加快。當(dāng)?shù)鞍纂擞昧繛?.0 g時(shí)，小球藻在1～8 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，能夠保持一定的生長(zhǎng)速度，A680值逐漸升高，小球藻生長(zhǎng)具有良好的穩(wěn)定性，有利于小球藻總量的累積；當(dāng)?shù)鞍纂擞昧繛?.0 g時(shí)，培養(yǎng)1～5 d，小球藻生長(zhǎng)速度最快，A680值快速升高，但繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，小球藻生長(zhǎng)速度減慢，A680值升高不明顯，說(shuō)明過(guò)快的增殖代謝，導(dǎo)致一部分小球藻死亡，并不利于小球藻總量的累積；當(dāng)?shù)鞍纂擞昧吭鲋?.0 g和6.0 g時(shí)，培養(yǎng)6 d后小球藻生長(zhǎng)速度有所加快，蛋白胨用量為5.0 g時(shí)的累積量最高，且穩(wěn)步增長(zhǎng)。表明，在500 mL培養(yǎng)基中，蛋白胨用量為5.0 g(質(zhì)量濃度1.00%)時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)情況最好。從節(jié)約成本考慮，蛋白胨用量為3.0 g(質(zhì)量濃度0.60%)是最經(jīng)濟(jì)的。

圖2為小球藻在以蛋白胨為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時(shí)的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來(lái)看，其結(jié)果與A680值(圖1)相符。

圖2 小球藻在以蛋白胨為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時(shí)的照片F(xiàn)ig.2 Photos of Chlorella zofingensis cultured with peptone as organic matter for 2 d and 8 d

2.2 小球藻在以酵母提取物為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖3)

從圖3可以看出，以酵母提取物為培養(yǎng)基有機(jī)質(zhì)時(shí)，小球藻生長(zhǎng)緩慢，且很不穩(wěn)定；培養(yǎng)5 d的累積量與以蛋白胨為有機(jī)質(zhì)時(shí)培養(yǎng)2～3 d的累積量相當(dāng)；以不同用量的酵母提取物為培養(yǎng)基有機(jī)質(zhì)時(shí)均容易導(dǎo)致小球藻死亡，出現(xiàn)生長(zhǎng)曲線下滑的情況，這可能與酵母提取物所含的營(yíng)養(yǎng)元素有關(guān)。

圖4為小球藻在以酵母提取物為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和5 d時(shí)的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來(lái)看，其結(jié)果與A680值(圖3)相符。

圖3 小球藻在以酵母提取物為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.3 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter

圖4 小球藻在以酵母提取物為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和5 d時(shí)的照片F(xiàn)ig.4 Photos of Chlorella zofingensis cultured with yeast extract as organic matter for 2 d and 5 d

2.3 小球藻在以牛肉膏為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)(圖5)

圖5 小球藻在以牛肉膏為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.5 Growth trend of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter

從圖5可以看出，當(dāng)牛肉膏用量為1.0～3.0 g時(shí)，小球藻經(jīng)過(guò)8 d的培養(yǎng)依然能夠保持一定的生長(zhǎng)速度，A680值逐漸升高，但小球藻累積量遠(yuǎn)不如以蛋白胨為有機(jī)質(zhì)時(shí)的累積量；當(dāng)牛肉膏用量為4.0 g時(shí)，小球藻在前7 d生長(zhǎng)穩(wěn)定，但第8 d開(kāi)始出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)；當(dāng)牛肉膏用量增至5.0～6.0 g時(shí)，則出現(xiàn)了明顯的抑制生長(zhǎng)現(xiàn)象。表明，牛肉膏用量越高越不利于小球藻的代謝。

圖6為小球藻在以牛肉膏為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時(shí)的照片，從培養(yǎng)液顏色深淺來(lái)看，其結(jié)果與A680值(圖5)相符。

圖6 小球藻在以牛肉膏為有機(jī)質(zhì)的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)2 d和8 d時(shí)的照片F(xiàn)ig.6 Photos of Chlorella zofingensis cultured with beef extract as organic matter for 2 d and 8 d

2.4 討論

3種常用微生物培養(yǎng)有機(jī)質(zhì)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響均與有機(jī)質(zhì)的化學(xué)組成相關(guān)。蛋白胨的分子量在2 000左右，介于和肽之間，是一個(gè)復(fù)雜的多肽混合物，是動(dòng)物性、植物性、微生物性的蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或蛋白酶分解后形成的，富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類，能為小球藻提供碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。酵母提取物是酵母菌破壁后經(jīng)抽提得到的蛋白質(zhì)、核酸、維生素等經(jīng)生物酶解得到的富含氨基酸、肽、核苷酸、維生素等天然活性成分的物質(zhì)，其中總蛋白50%以上，氨基酸30%以上，核苷酸10%以上。牛肉膏是新鮮牛肉剔除脂肪后經(jīng)消化、過(guò)濾、濃縮而得到的膏狀物，是含肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。

在微生物培養(yǎng)中，蛋白胨主要提供氮源和維生素，相比牛肉膏，蛋白胨的來(lái)源廣泛，可以為小球藻提供更多種類和數(shù)量的有機(jī)氮源(氨基酸和肽類)，完全可以滿足小球藻快速生長(zhǎng)的需要。牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，其主要作用是補(bǔ)充蛋白胨以及其它氮源的不足，用量一般為0.3%～0.5%；牛肉膏成分復(fù)雜，氮源是比較單一的動(dòng)物源性的，其它營(yíng)養(yǎng)成分雖然能促進(jìn)大部分微生物生長(zhǎng)，但并不適合小球藻的生長(zhǎng)，甚至和小球藻代謝物發(fā)生作用，從而起到抑制作用。與蛋白胨和牛肉膏相比，酵母提取物的氮源(可能主要是氨基酸)就更單一了，雖然其氨基酸和總蛋白含量很高，但是并不能滿足小球藻生長(zhǎng)的需要，可能與氨基酸的種類和含量有關(guān)。

3 結(jié)論

小球藻的快速生長(zhǎng)需要多種氮源，在額外提供無(wú)機(jī)離子的情況下，蛋白胨對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最大，其次是牛肉膏，酵母提取物幾乎不能促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)。在蛋白胨質(zhì)量濃度為1.00%時(shí)，小球藻的生物累積量達(dá)到最高；考慮到經(jīng)濟(jì)成本，蛋白胨的質(zhì)量濃度以0.60%為宜。