王 燕，高 潔，周 蕊

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)，又名小貫葉金絲桃圣約翰草(St.John’s wort) ，為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，具有抗抑郁、抗病毒、抑菌、止血、止咳、鎮(zhèn)痛等功效[1-3]。貫葉連翹全草富含多種有效成分，如雙蒽酮類化合物、蒽酚類化合物、黃酮類化合物、脂溶性成分、胡蘿卜素、維生素C及鞣質(zhì)等[4-5]。目前，關(guān)于貫葉連翹有效成分的研究主要集中在金絲桃素、黃酮類化合物上[6]，而對(duì)其它成分的研究較少，關(guān)于貫葉連翹中脂溶性成分的提取研究，尤其是超聲輔助法提取貫葉連翹脂溶性成分的研究尚未見報(bào)道。

超聲輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、空化、攪拌等超聲效應(yīng)的協(xié)同作用，提高物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，加速相互滲透溶解，提高油脂在溶劑中的溶解度，進(jìn)而提高出油率[7-8]。超聲輔助提取法是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛〖夹g(shù)，已廣泛應(yīng)用于天然藥物有效成分的提取。

響應(yīng)曲面法集統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)建模和計(jì)算機(jī)科學(xué)于一體，是優(yōu)化天然藥物有效成分提取工藝的有效方法，具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、可考察因素的交互作用等特點(diǎn)[9-10]。

作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化貫葉連翹脂溶性成分的超聲輔助提取工藝，以期為深度開發(fā)貫葉連翹資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

貫葉連翹，產(chǎn)地陜西，經(jīng)鑒定為藤黃科金絲桃屬(HypericumperforatumL.)的地上部分。

正己烷、無水乙醚、無水乙醇、無水硫酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FA型電子分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司。

1.2 貫葉連翹脂溶性成分的提取

貫葉連翹藥材預(yù)先粉碎，備用。稱取一定量的貫葉連翹藥材粉末于圓底燒瓶中，加入適量溶劑，連接冷凝回流裝置；在超聲功率為200 W(實(shí)驗(yàn)所選超聲設(shè)備的最大值)的條件下控制溫度，提取貫葉連翹脂溶性成分；提取完成后冷卻至室溫，過濾，真空濃縮揮發(fā)溶劑，得到黃色黏稠油狀液體物質(zhì)；干燥稱重，按下式計(jì)算脂溶性成分提取率(R)：

式中：m為脂溶性成分質(zhì)量，g；m0為貫葉連翹藥材粉末質(zhì)量，g。

1.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 提取溶劑的影響

分別以正己烷、石油醚、乙酸乙酯和乙醚為提取溶劑，在液固比為9∶1(mL∶g，下同)、提取溫度為45 ℃、提取時(shí)間為40 min的條件下提取貫葉連翹脂溶性成分，考察不同提取溶劑對(duì)提取率的影響。

1.3.1.2 液固比的影響

以正己烷為提取溶劑，在液固比分別為3∶1、6∶1、9∶1、12∶1、15∶1，提取溫度為45 ℃，提取時(shí)間為40 min的條件下提取貫葉連翹脂溶性成分，考察液固比對(duì)提取率的影響。

1.3.1.3 提取溫度的影響

以正己烷為提取溶劑，在提取溫度分別為15 ℃、30 ℃、45 ℃、60 ℃、75 ℃，液固比為9∶1，提取時(shí)間為40 min的條件下提取貫葉連翹脂溶性成分，考察提取溫度對(duì)提取率的影響。

1.3.1.4 提取時(shí)間的影響

以正己烷為提取溶劑，在提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，液固比為9∶1，提取溫度為45 ℃的條件下提取貫葉連翹脂溶性成分，考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取率為考核指標(biāo)，以提取溫度、提取時(shí)間、液固比為考察因素，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化貫葉連翹脂溶性成分的超聲輔助提取工藝。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用響應(yīng)曲面軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析和處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SE)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同提取溶劑對(duì)提取率的影響(圖1)

圖1 不同提取溶劑對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on extraction rate

從圖1可知，以正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，貫葉連翹脂溶性成分提取率分別為7.5%、6.5%、4.3%、5.8%，其中，以正己烷為提取溶劑時(shí)的提取率最高。因此，選擇正己烷作為提取溶劑。

2.1.2 液固比對(duì)提取率的影響(圖2)

圖2 液固比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate

從圖2可知，隨著液固比的增大，貫葉連翹脂溶性成分提取率逐漸升高，當(dāng)液固比增大至9∶1時(shí)，基本提取完全，提取率達(dá)到最高；繼續(xù)增大液固比，提取率緩慢下降。這是因?yàn)椋黾犹崛∪軇┯昧?，超聲空化作用逐漸增強(qiáng)，脂溶性成分溶出量增加，提取率相應(yīng)升高。因此，液固比選擇9∶1較為適宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)提取率的影響(圖3)

圖3 提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

從圖3可知，隨著提取溫度的升高，提取率先升高后降低，在提取溫度為45 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)?，提取溫度過高，正己烷揮發(fā)過多，導(dǎo)致提取率下降。故，在提取過程中應(yīng)適時(shí)補(bǔ)充正己烷，控制提取溫度為45 ℃較為適宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響(圖4)

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

從圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間由20 min延長(zhǎng)至40 min時(shí)，貫葉連翹脂溶性成分提取率呈線性快速升高；但繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率變化不大。這是因?yàn)?，提取過程中隨著濃度差引起的擴(kuò)散力的逐漸增大，脂溶性成分快速溶出，提取率快速升高；當(dāng)滲透壓達(dá)到平衡時(shí)，脂溶性成分基本被提取完全，提取率不再升高。因此，提取時(shí)間選擇40 min較為適宜。

2.2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1，方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

水平因素A.提取溫度/℃B.提取時(shí)間/minC.液固比/(mL∶g)-135306∶10 4540 9∶11 55 50 12∶1

表2響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

Tab.2 Design and results of response surface methodologies

實(shí)驗(yàn)號(hào)A℃BminCmL∶gR實(shí)測(cè)%R預(yù)測(cè)%135406∶17.016.92245409∶19.289.01335509∶16.126.244354012∶16.246.315454012∶17.948.12635309∶16.697.02745306∶18.46 9.24855406∶19.038.82945409∶19.319.811045506∶18.449.241155509∶18.939.0112453012∶17.808.2113554012∶18.517.95 1455309∶18.298.621545409∶19.349.45

2.2.1 回歸模型方程的建立

以脂溶性成分提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 7.1.3軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到貫葉連翹脂溶性成分超聲輔助提取工藝的多元二次回歸方程模型：R=-25.96437+0.98825A+0.39025B+0.71083C+(3.02500E-003)AB+(2.08333E-003)AC+(1.33333E-003)BC-0.011325A2-(6.70000E-003)B2-0.053333C2。

2.2.2 方差分析

對(duì)上述模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方差分析結(jié)果見表3。

表3方差分析

Tab.3 Analysis of variance

實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差sd=0.035，表明實(shí)驗(yàn)過程誤差較小。因此，該模型對(duì)貫葉連翹脂溶性成分的提取條件優(yōu)化是可行的。同時(shí)，可以明顯看出AC項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有顯著影響(P<0.05)，A、C、AB、A2、B2、C2項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有極顯著影響(P<0.01)。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)貫葉連翹脂溶性成分超聲輔助提取工藝的多元二次回歸方程模型繪制的響應(yīng)曲面圖、等高線圖如圖5所示，響應(yīng)曲面的方差分析如圖6所示。

從圖5a可知，當(dāng)液固比為9∶1時(shí)，隨著提取溫度的升高，貫葉連翹脂溶性成分提取率呈快速上升趨勢(shì)，隨后又出現(xiàn)下降趨勢(shì)；提取時(shí)間對(duì)提取率的影響曲線較為平緩；提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響極為顯著。提取溫度的合適水平范圍為43～53 ℃，提取時(shí)間的合適水平范圍為36～46 min。

從圖5b可知，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，液固比、提取溫度以及兩者交互作用對(duì)貫葉連翹脂溶性成分提取率的影響均比較顯著。提取溫度的合適水平范圍為43～53 ℃，液固比的合適水平范圍為(6.56～9.69)∶1。

圖5 各因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effects of each factors on extraction rate

從圖5c可知，當(dāng)提取溫度為45 ℃時(shí)，液固比對(duì)貫葉連翹脂溶性成分提取率的影響較顯著；液固比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率的影響不顯著。提取時(shí)間的合適水平范圍為36～46 min、液固比的合適水平范圍為(6.56～9.69)∶1。

圖6 響應(yīng)曲面的方差分析圖Fig.6 Analysis of variance for response surface

從圖6可知，提取率實(shí)際測(cè)定值和預(yù)測(cè)值分布幾乎在同一直線上(圖6a)，提取率測(cè)定值與各因素的擬合效果良好(圖6b)。因此，該模型能夠很好地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可用于貫葉連翹脂溶性成分的超聲輔助提取工藝優(yōu)化。

2.2.4 最優(yōu)提取工藝

對(duì)模型方程求導(dǎo)計(jì)算得到超聲輔助提取貫葉連翹脂溶性成分的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度47.95 ℃、提取時(shí)間41.24 min，此條件下，貫葉連翹脂溶性成分的提取率為9.54%?；趯?shí)際操作及經(jīng)濟(jì)因素，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行修正，得到最優(yōu)提取工藝條件為：以正己烷為提取溶劑、超聲功率200 W、提取溫度48 ℃、提取時(shí)間41 min、液固比9∶1(mL∶g)，在此條件下平行3 次實(shí)驗(yàn)，得到的提取率為9.45%(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%)。

3 結(jié)論

以正己烷為溶劑，采用超聲輔助法提取貫葉連翹脂溶性成分，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)曲面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝條件為：超聲功率200 W、提取溫度48 ℃、提取時(shí)間41 min、液固比9∶1(mL∶g)，在此條件下，貫葉連翹脂溶性成分提取率達(dá)到9.45%(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%)。該提取工藝具有設(shè)備簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、成本低等特點(diǎn)，為貫葉連翹有效成分的進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。