牛占忠 劉丁丁 岳 雁 張喜平

(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校針推教研室，河北 滄州 061001)

慢性疲勞綜合征是一組癥候群，以慢性疲勞為主要癥狀，常伴焦慮、抑郁、失眠、無固定部位的疼痛、不適、性功能低下、免疫力低下引起的類似感冒癥狀等表現(xiàn)。目前本病發(fā)病率極高，尤其是在大中城市，確切發(fā)病病因不明，嚴(yán)重影響人們的身體健康。有資料表明，慢性疲勞綜合征的發(fā)生與下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸調(diào)節(jié)過程出現(xiàn)異常相關(guān)，還與5-羥色胺(5-HT)功能低下有關(guān)[1-3]。還有研究表明，慢性疲勞綜合征的發(fā)生與自由基的代謝關(guān)系密切[4-5]。我們臨床應(yīng)用補(bǔ)腎疏肝湯治療慢性疲勞綜合征取得了良好效果[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過研究補(bǔ)腎疏肝湯對慢性疲勞綜合征大鼠模型抗疲勞的作用機(jī)制，為補(bǔ)腎疏肝湯治療慢性疲勞綜合征提供確切的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性健康SD大鼠50只，清潔級，體質(zhì)量230～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)201520001。飼養(yǎng)動物環(huán)境：實(shí)驗(yàn)室清潔飼養(yǎng)，溫度21～26 ℃，濕度50%左右，噪聲<60 dB，照明12 h明、12 h暗。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎疏肝湯藥物組成：熟地黃20 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，生地黃20 g，玄參15 g，麥冬15 g，當(dāng)歸12 g，川芎10 g，柴胡10 g，枳殼10 g，黃芩12 g，黃連6 g，甘草6 g。按原方比例加重蒸水浸泡1 h后煎煮，武火煎開，文火繼續(xù)煎煮20 min，然后濾取藥液，藥渣再加重蒸水煎煮20 min后濾取藥液。2次所取藥液混合，濃縮至含生藥2 g/mL，滅菌密封備用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號:2015926)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號：20151012)、5-HT免疫組化試劑盒(批號：2015612)，均由南京建成生物工程研究所提供。大鼠過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(批號:20150413)、大鼠細(xì)胞色素C氧化酶(COX)ELISA試劑盒(批號:20150721)，均由蘇州卡爾文生物科技有限公司提供。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠實(shí)驗(yàn)泳缸(自制)、剝奪睡眠所用加鐵絲網(wǎng)的塑料盆(自制)、電子天平(上海英衡電子秤有限公司)、秒表(武漢雙龍旭光體育器材有限公司)、超聲波細(xì)胞粉碎儀(寧波唯誠超聲波設(shè)備科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將50只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即空白組、模型組及補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組，各組均10只。

1.2.2 模型制備 采用文獻(xiàn)[8]中力竭游泳加剝奪睡眠20 h方法制備慢性疲勞綜合征模型?？瞻捉M大鼠不參加模型制備。每日9:00，讓除空白組外其他各組大鼠在自制的實(shí)驗(yàn)泳缸中進(jìn)行1次力竭游泳。泳缸長100 cm、寬40 cm、高60 cm。其中儲水深度50 cm，水溫(25±1) ℃。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，先記錄大鼠體質(zhì)量，并在大鼠尾巴根部綁縛相當(dāng)于其體質(zhì)量5%的負(fù)重鉛皮，然后將大鼠放入泳缸中進(jìn)行負(fù)重游泳并開始計(jì)時(shí)。當(dāng)大鼠達(dá)到力竭狀態(tài)(即大鼠游泳姿態(tài)失常，出現(xiàn)慌張表現(xiàn)，肢體動作失調(diào)，在水中活動范圍減小，經(jīng)常打圈，不能在大范圍內(nèi)來回游動，甚至僅能在一個角落勉強(qiáng)保持鼻尖露出水面。或大鼠完全沉沒于水中，不能自行浮出達(dá)10 s),將其撈出，記錄游泳持續(xù)時(shí)間，即力竭游泳時(shí)間。并用毛巾將其身體擦干，用電熱風(fēng)機(jī)吹干皮毛，將其放入鼠籠中休息，予正常飲食及水，保持環(huán)境溫度在21～26 ℃。當(dāng)日13：00給予大鼠剝奪睡眠處理。將大鼠放入盛水的塑料盆中，水深1.5 cm，使大鼠不能安然入睡，然后用鐵絲網(wǎng)封固，防止大鼠逃脫。同時(shí)供應(yīng)大鼠正常食物和水，持續(xù)至第2 d 9：00，進(jìn)行下一周期的力竭游泳加剝奪睡眠20 h。每日1次，連續(xù)14 d。

1.2.3 給藥方法 在造模同時(shí)，空白組、模型組均予0.9%氯化鈉注射液40 mL/(kg·d)灌胃；補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組分別予補(bǔ)腎疏肝湯40 mL/(kg·d)灌胃，其含生藥量分別為17.28、34.56、69.12 g/(kg·d)，分別相當(dāng)于人體用量1、2、4倍。均連續(xù)灌胃14 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 ①比較各組大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳時(shí)間。②在大鼠第14 d末次力竭游泳后禁食24 h，0.03%水合氯醛腹腔麻醉后腹主動脈取血，應(yīng)用比色法檢測血清MDA、SOD水平。③分離出大鼠全腦，去除兩側(cè)菱形突起，切取中央部分的下丘腦標(biāo)本，用免疫組化法檢測5-HT含量。④快速取出各組大鼠后肢骨骼肌組織1塊，稱取1 g放入0.9%氯化鈉注射液中漂洗去血液，用濾紙拭干后，將組織加入適量0.9%氯化鈉注射液搗碎，3 000 r/min離心10 min，取上清液制成骨骼肌組織勻漿，分裝標(biāo)號置于-20 ℃冰柜中保存。由專業(yè)人員按PGC-1α ELISA試劑盒說明書中的步驟檢測大鼠骨骼肌中PGC-1α含量。將取好的骨骼肌組織剪碎，移至預(yù)冷的玻璃勻漿器中，按照5 mL/g用量加入分離介質(zhì)[pH=7.4，蔗糖0.25 mol/L，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)0.005 mol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.001 mol/L]，上下勻漿30次，將勻漿液低溫1 200 r/min離心10 min，取其上清液；再用低溫超速12 000 r/min離心20 min，棄其上清液，其沉淀部分即為線粒體。加入2 mL分離介質(zhì)，制成線粒體勻漿液，再用超聲波細(xì)胞粉碎儀打碎線粒體膜結(jié)構(gòu)，制成線粒體懸浮液，分裝標(biāo)號置于-20 ℃冰柜中保存。整個過程在0～4 ℃進(jìn)行。按COX ELISA檢測試劑盒說明書中的步驟檢測大鼠骨骼肌中COX含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠第1 d首次、第14 d末次力竭游泳時(shí)間比較 見表1。

組 別n第1 d首次力竭游泳時(shí)間第14 d末次力竭游泳時(shí)間空白組10__模型組10741.0±143.5496.0±94.6補(bǔ)腎疏肝湯低劑量組10729.0±197.4643.0±112.9?△#補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組10746.0±157.8907.0±172.8?#補(bǔ)腎疏肝湯高劑量組10735.0±178.3719.0±101.2?△

與模型組比較，*P<0.05；與補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組比較，△P<0.05；與本組第1 d首次力竭游泳時(shí)間比較，#P<0.05

由表1可見，補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時(shí)間均較模型組延長(P<0.05)，且補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時(shí)間最長(P<0.05)。補(bǔ)腎疏肝湯低劑量組第14 d末次力竭游泳時(shí)間較第1 d首次力竭游泳時(shí)間縮短(P<0.05)；補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組第14 d末次力竭游泳時(shí)間較第1 d首次力竭游泳時(shí)間延長(P<0.05)。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較 見表2。

組 別nSOD(U/mL)MDA(nmol/mL)空白組10142.52±14.904.39±0.51模型組10114.84±8.32?7.79±0.80?補(bǔ)腎疏肝湯低劑量組10136.44±18.53△#4.54±0.66△#補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組10172.97±16.38△3.46±0.56△補(bǔ)腎疏肝湯高劑量組10163.28±13.79△#5.98±0.61#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

由表2可見，模型組大鼠血清SOD水平低于空白組(P<0.05)，MDA水平高于空白組(P<0.05)。補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠血清SOD水平均高于模型組(P<0.05)，補(bǔ)腎疏肝湯低、中劑量組大鼠MDA水平低于模型組(P<0.05)。補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組大鼠血清SOD水平高于補(bǔ)腎疏肝湯低、高劑量組(P<0.05)，MDA水平低于補(bǔ)腎疏肝湯低、高劑量組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠下丘腦5-HT含量比較 見表3。

組 別n5-HT(pg/mL)空白組1012.82±1.73模型組109.18±1.47?補(bǔ)腎疏肝湯低劑量組109.44±1.53補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組1011.97±2.03△補(bǔ)腎疏肝湯高劑量組1010.41±1.83△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

由表3可見，模型組大鼠下丘腦5-HT含量低于空白組(P<0.05)。補(bǔ)腎疏肝湯中、高劑量組大鼠下丘腦5-HT含量均高于模型組(P<0.05)，且補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組高于補(bǔ)腎疏肝湯高劑量組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量比較 見表4。

由表4可見，模型組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均低于空白組(P<0.05)。補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型組(P<0.05)，且補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量最高(P<0.05)。

組 別nPGC-1α(nmol/L)COX(nmol/mg)空白組10231.28±19.68120.89±9.86模型組10154.25±20.36?78.12±10.08?補(bǔ)腎疏肝湯低劑量組10179.22±18.75△#108.54±8.93△#補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組10208.32±16.39△128.36±14.43△補(bǔ)腎疏肝湯高劑量組10192.45±17.96△#124.66±11.65△#

與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組比較，#P<0.05

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎中元?dú)膺\(yùn)行全身各處，以維持全身各臟腑、組織、器官的生理功能。元?dú)獬渥銊t全身各臟腑、組織、器官功能正常；元?dú)獠蛔悖瑒t各臟腑、組織、器官功能低下。同時(shí)，腎中元?dú)馔ㄟ^肝的疏泄作用運(yùn)行全身各處，肝的疏泄功能不正常，元?dú)獠荒芡ㄟ^經(jīng)絡(luò)流通到全身各處，各臟腑、組織、器官不能得到元?dú)獬漯B(yǎng)而功能低下。這時(shí)，人就會出現(xiàn)慢性疲勞綜合征所表現(xiàn)出的癥狀，如疲勞、乏力、氣短、腰痠、煩躁、失眠、抑郁、焦慮、性功能低下等癥狀。故腎虛和肝郁是慢性疲勞綜合征發(fā)病的重要病機(jī)。補(bǔ)腎疏肝湯正是依據(jù)這一病機(jī)制定的方劑。方中熟地黃、淫羊藿、枸杞子、生地黃、玄參、麥冬滋陰壯陽，補(bǔ)助腎氣；當(dāng)歸、川芎養(yǎng)血行血；柴胡、枳殼疏肝理氣；黃芩、黃連清肝郁之火。諸藥合用，起到補(bǔ)腎、疏肝的功效。

目前，慢性疲勞綜合征的發(fā)生機(jī)制尚不確切，認(rèn)為氧自由基和脂質(zhì)過氧化過程與疲勞的產(chǎn)生有著密切關(guān)系。氧自由基在脂質(zhì)過氧化過程中起決定性作用，促進(jìn)MDA生成。體內(nèi)產(chǎn)生的MDA可使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化，因?yàn)轶w內(nèi)的酶由蛋白質(zhì)構(gòu)成，所以MDA可使一些酶發(fā)生變性，失去應(yīng)有的活性。大量氧自由基對細(xì)胞內(nèi)線粒體及其他細(xì)胞器造成損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老、凋亡[9-10]，使機(jī)體組織器官功能低下，產(chǎn)生疲勞。所以MDA可作為衡量機(jī)體細(xì)胞功能損傷的一個指標(biāo)，間接反映機(jī)體疲勞狀態(tài)。同時(shí)，氧自由基的生成過程也受到一定限制。氧自由基的產(chǎn)生可被機(jī)體內(nèi)某些抗氧化劑或抗氧化酶阻止，抗氧化劑和抗氧化酶間接起到了保護(hù)細(xì)胞免受損傷的作用。比如機(jī)體細(xì)胞中的SOD可催化超氧陰離子歧化為過氧化氫(H2O2)和氧(O2)，進(jìn)而清除氧自由基，使機(jī)體細(xì)胞免受氧自由基的損傷。當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗氧化劑和抗氧化酶不足時(shí)，細(xì)胞損傷加重。當(dāng)抗氧化劑和抗氧化酶被消耗完后，細(xì)胞線粒體受到損傷，出現(xiàn)功能障礙，影響細(xì)胞代謝，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使機(jī)體組織損傷，功能低下。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎疏肝湯可使慢性疲勞綜合征大鼠血清SOD升高，MDA下降。說明補(bǔ)腎疏肝湯通過增強(qiáng)機(jī)體自身抗氧化酶活性，進(jìn)而提高自身抗氧化能力，提高清除體內(nèi)氧自由基，減少氧自由基對機(jī)體的損傷，而起到消除疲勞的作用。

慢性疲勞綜合征的產(chǎn)生與內(nèi)分泌系統(tǒng)關(guān)系密切，內(nèi)分泌紊亂是慢性疲勞綜合征形成的基礎(chǔ)之一。機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)由下丘腦控制。HPA軸是內(nèi)分泌系統(tǒng)的通路，由下丘腦控制，其功能紊亂可導(dǎo)致疲勞產(chǎn)生。常見的單胺類遞質(zhì)如多巴胺、5-HT等對HPA軸的調(diào)控有重要作用，與人體的許多生理活動關(guān)系密切。當(dāng)下丘腦5-HT含量充足，機(jī)體處于興奮狀態(tài)時(shí)，人表現(xiàn)為情緒高漲，思維敏捷，動作精準(zhǔn)、有力，意志力堅(jiān)定，飲食、睡眠正常。當(dāng)下丘腦5-HT含量不足時(shí)，人體處于抑制狀態(tài)，表現(xiàn)為疲勞[11-12]。所以，下丘腦5-HT含量可反映機(jī)體慢性疲勞狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)腎疏肝湯中、高劑量組大鼠下丘腦5-HT水平均高于模型組(P<0.05)，提示補(bǔ)腎疏肝湯可能通過調(diào)節(jié)5-HT回歸正常水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)HPA軸來緩解大鼠的慢性疲勞。

有研究表明，PGC-1α是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，它在機(jī)體組織中分布具有特異性，在需要提供比較多能量的組織中分布較多，而在需要能量較少的組織中分布較少[13]。在機(jī)體需要提供比較多能量的組織如心肌、骨骼肌中分布最多。PGC-1α參與機(jī)體內(nèi)很多代謝過程。線粒體是細(xì)胞生產(chǎn)能量的場所，在線粒體中，細(xì)胞通過氧化磷酸過程生成大量腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，ATP是機(jī)體生命活動的基本物質(zhì)，為機(jī)體各種生理活動提供能量。PGC-1α能調(diào)控線粒體在體內(nèi)的合成。在機(jī)體需要大量能量時(shí)，PGC-1α可調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生大量線粒體，并且可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生大量ATP[14]。此外，PGC-1α蛋白可使機(jī)體增加Ⅰ型肌纖維的比例。Ⅰ型肌纖維含有更多的線粒體，在機(jī)體耗氧量增多時(shí)可提供更多能量。所以，機(jī)體中Ⅰ型肌纖維的含量比例高是抗疲勞能力高的標(biāo)志。骨骼肌中PGC-1α的含量間接反映了機(jī)體對抗疲勞的能力，因此骨骼肌中PGC-1α含量可作為衡量機(jī)體抗疲勞的指標(biāo)。COX是細(xì)胞器線粒體上的一種氧化還原酶，也是線粒體上具有標(biāo)志意義的酶，線粒體的氧化呼吸依靠它來完成。COX可催化還原型細(xì)胞色素C氧化，通過此反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的氧化磷酸化過程，產(chǎn)生能為細(xì)胞、組織提供能量的ATP[15]。所以，線粒體中COX活性與線粒體產(chǎn)生的能量關(guān)系密切，機(jī)體骨骼肌中COX含量的增高提示機(jī)體內(nèi)能量產(chǎn)生增多，也反映了機(jī)體抗疲勞能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠骨骼肌PGC-1α、COX含量均高于模型組(P<0.05)，說明補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組均可提高機(jī)體骨骼肌中PGC-1α、COX的含量，具有抗疲勞作用。

在慢性疲勞的動物實(shí)驗(yàn)中，體能測定是判斷動物抗疲勞的指標(biāo)之一，而力竭游泳時(shí)間是反映體能的直觀指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)腎疏肝湯低、中、高劑量組大鼠第14 d末次力竭游泳時(shí)間均較模型組延長(P<0.05)，說明補(bǔ)腎疏肝湯可以增加疲勞大鼠力竭游泳時(shí)間，增強(qiáng)大鼠體力，具有抗疲勞作用，而補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組作用更明顯(P<0.05)。

綜上所述，補(bǔ)腎疏肝湯對慢性疲勞綜合征大鼠模型具有抗疲勞作用，效果確切,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)觀察，補(bǔ)腎疏肝湯中劑量組更值得臨床研究。